摘要间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作为重要的成体干细胞之-具有跨系统、跨胚层分化的潜能以及来源广泛、取材方便、易分离纯化、免疫原性低、扩增力强、能够向肿瘤迁移等特性,是干细胞疗法中的重要种子细胞。目前,MSCs除在治疗组织缺损、器官退行性疾病等方面取得了重要进展以外,人们正在尝试将其用于肿瘤预防和治疗。本实验主要通过体内外实验研究MSCs对肝癌细胞HepG2的抑制作用以及Wnt/β-catenin信号通路中的关键因子的变化,从而探讨MSCs对HepG2细胞的抑制及其分子机制。利用MTT法检测MSCs条件培养液或共培养对HepG2细胞的体外抑制作用。条件培养液组分为MSCs条件培养液和293条件培养液组,具体分组如下：HepG2培养基对照组、MSCs专用培养基对照组、20%条件培养液实验组、40%条件培养液实验组、60%条件培养液实验组、80%条件培养液实验组、100%条件培养液实验组；共培养组分为MSCs或HEK 293细胞系(作为对照)和HepG2共培养,具体分为4个比例组(10：1、5：1、1：1、1：5),分别于24 h、48 h和72 h后检测MSCs对HepG2细胞的抑制作用；采用流式细胞仪分析MSCs诱导HepG2凋亡的情况；利用RT-PCR方法检测MSCs条件培养液或共培养作用HepG2细胞后Wnt信号通路关键因子(bcl-2、c-Myc、β-catenin和survivin)的表达变化；利用Western blot检测MSCs条件培养液作用HepG2细胞后bcl-2的表达变化；通过ELISA试剂盒检测MSCs分泌Dkk-1因子的含量；在体内实验中,按不同比例将MSCs和HepG2细胞注射于裸鼠腋下,观察肿瘤的生长情况；制作冰冻切片并用H.E染色观察肿瘤组织的病理形态,以研究MSCs对HepG2细胞的体内抑制情况。MTT实验结果表明,在条件培养液组中,除20%的MSCs的条件培养液对HepG2细胞没有抑制作用外(P>0.05),40%、60%、80%和100%条件培养液实验组均见明显的抑制作用(P<0.05)；MSCs与HepG2共培养的10：1、5：1和1：1实验组与对照组相比,24、48和72小时MSCs对HepG2均具有明显的抑制作用；1：5的实验组与对照组相比,MSCs对HepG2的抑制作用不明显。在凋亡实验中,MSCs:HepG2=5:1和1：1共培养组的48和72小时可显著诱导HepG2细胞凋亡RT-PCR检测发现,经过MSCs条件培养液处理HepG2细胞24、48和72小时后,HepG2细胞的bcl-2、c-Myc、β-catenin和survivin的表达量与对照组相比明显下降；MSCs与HepG2细胞共培养24、48和72小时后,MSCs:HepG2=5:1和MSCs:HepG2=1:1的实验组中,HepG2细胞β-catenin、survivin、bcl-2和c-Myc的表达量与对照组相比均下调；MSCs:HepG2=1:5的实验组中,HcpG2细胞β-catenin、survivin、bcl-2和c-Myc的表达量与对照组相比均未见表达下调。Western blot实验中,经过MSCs条件培养液处理的HepG2细胞的bcl-2的表达与对照组相比表达下调。利用ELISA试剂盒检测MSCs上清发现,Dkk-1因子的含量远远超过HEK293细胞上清中的含量。在裸鼠移植瘤实验中,MSCs:HepG2=2:1组和MSCs: HepG2=1:2组与HepG2对照组相比,肿瘤生长明显被抑制。而HEK 293:HepG2=1:1组与HepG2对照组和HEK 293:HepG2=1:2组与2HepG2对照组相比,肿瘤生长没有被抑制。肿瘤组织的切片结果显示,MSCs:HepG2=2:1组的肿瘤组织中肿瘤细胞分布较少,结缔组织较多。而HEK 293:HepG2=2:1组及HEK 293:HepG2=1:1组的肿瘤组织中肿瘤细胞更加密集,染色较深。MSCs具有抑制肝癌细胞系HepG2增殖、促进其凋亡的能力,而且具有数量和时间依赖性。MSCs通过分泌可溶性分子Dkk-1,抑制肿瘤细胞内Wnt信号通路中的关键因子bcl-2、c-Myc、β-catenin和survivin的表达从而抑制HepG2细胞增殖、促进其凋亡。因此,本实验的研究为MSCs应用于肿瘤的治疗提供了新途径和实验依据,拓展了干细胞的应用前景。