本文拟通过同种异基因脾细胞输注的方法建立致敏的动物模型，深入探讨致敏对HSCT的影响及作用机制。 第一部分脾细胞输注致敏模型的建立及其对移植的影响 目的：建立脾细胞致敏的动物模型，研究致敏动物体内免疫功能的改变，并探讨致敏对HS/PCs植入的影响。 方法： 1.致敏模型的建立,于脾细胞输注结束后第7天检测BALB/c小鼠的免疫功能并将其作为移植受者。 2.免疫功能检测： 2.1由尾静脉采血检测各组受者血常规及应用流式细胞仪检测脾细胞CD3+、CD19+、CD4+、CD8+细胞百分比。 2.2分离各组受者的血清，通过补体依赖淋巴细胞毒性实验检测血清抗体滴度，ELISA方法检测血清中细胞因子IFN—γ的水平。 2.3分离各组致敏受者的脾细胞作为效应细胞，C57BL/6小鼠脾脏细胞作为刺激细胞，以3H—TdR进行标记，通过混合淋巴细胞反应计算刺激指数。 3.异基因骨髓移植： 3.1移植前5天各组BALB/c小鼠开始饮用含抗生素的饮用水，同时建立照射未移植组。 3.2每天观察移植后受鼠的生存情况，濒死动物取肝、肺、脾、肠管、足垫皮肤等组织作病理检查。 4.统计分析：采用SPSS16.0统计软件。 结果： 1.各组受者血象及外周血中CD3+、CD19+、CD4+、CD8+细胞百分比的差异均无明显统计学意义。 2.致敏血清中细胞毒性指数均高于正常对照组，且其数值与脾细胞输注的数量及次数呈正相关。 3.各组血清中IFN—γ均很低，致敏组血清IFN—γ与正常组的差别均无统计学意义。 4.MLR实验结果示1×10E5组的刺激指数稍高于正常组，但其差别无统计学意义；而1×10E6组及1×10E6 qw×2组的刺激指数均明显高于正常组，差别有统计学意义。 5.单纯照射未移植组的小鼠于照射后10～16天全部死亡。 6.濒死前取股骨病理检查证明骨髓细胞明显衰竭，而肝脏、肠管、皮垫等组织均未发现明显的淋巴细胞浸润。 结论： 1.通过同种异基因脾细胞输注的方法建立了不同致敏程度的动物模型。 2.异基因供者HS/PCs不能挽救经致死量照射的脾细胞输注致敏模型。 3.1×10E6 qw×2脾细胞输注组的致敏程度最高，符合临床反复输血致敏的过程，将以此致敏模型进行以下的实验研究。 第二部分异基因造血干/祖细胞在致敏模型的归巢与植入 目的：探讨异基因HS/PCs在致敏模型的归巢与植入情况，明确异基因HS/PCs在致敏受者体内的去向。 方法： 1.致敏模型与骨髓移植。 2.归巢的观察指标： 2.1 CFSE标记供者骨髓细胞：取染色后的骨髓细胞即时及体外培养48小时后予流式细胞仪检测，另取染色后的骨髓细胞即时进行移植。 2.2病理切片示踪：分别于移植后第2hr、12hr及48hr处死移植受者，取其眼静脉血进行涂片，并取股骨、脾脏、肝脏及肺脏行冰冻切片，于荧光显微镜下计数每个视野中荧光细胞数。 2.3流式细胞仪检测：同时于上述时点制备致敏模型的脾脏细胞、骨髓细胞及眼静脉血，以红细胞裂解液溶解红细胞，流式细胞仪检测绿色荧光的强度。 3.植入的观察指标： 3.1生存分析：移植后每日观察致敏模型的生存状况，记录死亡时间，绘制生存曲线。 3.2外周血象恢复：移植后每周从致敏模型尾静脉采血20μl，用KX—21血细胞计数仪检测WBC、Hb及PLT等。 3.3骨髓细胞计数：移植后每周分离致敏模型的股骨，计数每根股骨中骨髓细胞的数量，并取骨髓细胞进行以下集落培养及嵌合分析。 3.4集落培养：取2×104骨髓细胞置于1ml甲基纤维素半固体培养体系进行集落培养，7天后计算CFU—GM集落数。 3.5嵌合分析：取受者骨髓细胞予FITC—H—2Db标记，检测供者HS/PCs嵌合程度。 4.统计分析：与第一部分相同。 结果： 1.予绿色荧光染料CFSE体外标记供者骨髓细胞，两者差异无统计学意义。 2.归巢实验的冰冻切片结果显示，荧光标记供者细胞在受者肝脏、肺脏的分布随时间推移呈逐渐减少。 3.流式细胞仪结果显示移植后2小时，荧光细胞在非致敏组与致敏组的骨髓及脾脏的分布无明显差异。 4.非致敏及致敏受者予照射及异基因骨髓移植后经Log—rank检验两组的生存率差异有明显统计学意义。 5.非致敏组受者于移植照射后其血象及骨髓细胞随时间推移呈进行性增加，于移植后第28天已恢复到正常水平；而致敏组受者同样经照射移植后其血象及骨髓细胞随时间推移呈进行性下降。 6.移植后取受者骨髓细胞进行集落培养。 7.供者细胞嵌合分析结果。 结论： 1.归巢实验表明，与非致敏移植受者相比，异基因供者HS/PCs主要在致敏受者外周血、骨髓及脾脏等部位被清除。 2.通过植入实验的多种研究方法表明异基因供者HS/PCs在非致敏受者体内能有效植入，而在致敏受者体内却被完全排斥。 第三部分致敏对异基因造血干/祖细胞损伤的机制研究 目的：分析致敏受者血清及免疫细胞对异基因HS/PCs的损伤作用，探讨致敏受者产生移植排斥的机制。 方法： 1.致敏模型：同样按第一部分建立的致敏模型。 2.二抗结合实验：应用流式细胞仪进行检测。 3.免疫损伤机制： 3.1 CDC实验：将致敏或非致敏BALB/c小鼠的血清与C57BL/6骨髓细胞于体外孵育不同时间，再加入兔补体继续孵育30 min，然后予荧光染料EB/AO标记，计算细胞死亡百分比。 3.2 CTL实验：分离致敏或非致敏BALB/c小鼠脾细胞，检测骨髓细胞的死亡百分比，计算细胞毒性指数。 3.3 ADCC实验：再加入荧光标记PE—PI，计算细胞毒性指数。 4.血清对HS/PCs凋亡的影响：加荧光标记FITC—AnnexinV，应用流式细胞仪进行检测。 5.血清对造血祖细胞增殖分化的影响：C57BL/6骨髓细胞与致敏或非致敏BALB/c小鼠的血清于37℃孵育90min，然后加入终浓度为10％的兔补体，再孵育30min，洗涤后重悬细胞，骨髓细胞置于1ml甲基纤维素半固体培养体系进行集落培养，计数CFU—GM。 6.血清孵育或过继输注的移植实验： 6.1将致敏或非致敏BALB/c小鼠的血清与供者C57BL/6骨髓细胞在体外孵育1小时，洗涤后回输到经8Gy照射后的BALB/c小鼠，观察移植后的生存情况。 6.2在移植前1天将200μl致敏或非致敏BALB/c小鼠的血清注射到正常BALB/c小鼠中，经8Gy照射后予移植1×107C57BL/6小鼠的骨髓细胞，观察移植后生存情况。 7.统计分析：与第一部分相同。 结果： 1.经非致敏或致敏血清孵育的骨髓细胞与羊抗鼠IgG二抗结合，两组差别有明显统计学意义。 2.CDC实验结果示在与补体孵育30min或1hr后，致敏血清组死亡细胞百分比明显高于非致敏血清组，其差异有统计学意义。CTL实验中，非致敏血清组与致敏血清组的细胞毒性指数差别有明显统计学意义；ADCC实验中，两组的细胞毒性指数差别有统计学意义。 3.凋亡实验结果示非致敏组与致敏组的骨髓细胞，两组差异无明显统计学意义。 4.集落培养结果示非致敏组与致敏组的骨髓细胞中CFU—GM数量差异无统计学意义。 5.血清孵育骨髓细胞后进行移植，经Log—rank检验两组的生存率差异有明显统计学意义。 6.血清过继移植实验中，移植前予致敏血清输注的受者有80％也于移植后10天左右均死于骨髓衰竭，而接受非致敏血清输注的受者能长期存活，经Log—rank检验两组的生存率差异有明显统计学意义。 结论： 1.致敏血清抗体能与异基因HS/PCs相结合，致敏受者能通过免疫途径CDC、CTL、ADCC等免疫途径损伤异基因HS/PCs。 2.致敏血清对异基因HS/PCs凋亡及体外增殖分化均无明显影响。 3.血清孵育及过继移植实验均表明致敏血清能引起异基因HS/PCs的移植失败，说明血清抗体介导的体液免疫在移植排斥中发挥重要作用。 全文结论 1.通过同种异基因脾细胞输注的方法建立不同致敏程度的动物模型，该致敏模型体内免疫功能的变化与脾细胞输注的数量及次数有关。 2.归巢实验表明，异基因供者HS/PCs主要在致敏受者外周血、骨髓及脾脏等部位被清除。 3.通过植入实验的多种研究方法表明异基因供者HS/PCs在非致敏受者体内能有效植入，而在致敏受者体内却被完全排斥。 4.致敏血清抗体能与异基因HS/PCs相结合，致敏受者能通过免疫途径CDC、CTL、ADCC等免疫途径损伤异基因HS/PCs；但致敏血清对异基因HS/PCs凋亡及集落形成均无明显影响。 5.致敏血清能引起异基因HS/PCs的移植失败，说明血清抗体介导的体液免疫在移植排斥中发挥重要作用。