新城疫(ND)是一种急性、高度接触性传染病,主要侵害鸡和火鸡,亦可感染其它禽类、鸟类和人。国际兽医局(Office Internation des Epizooties,OIE)将其与高致病性禽流感同列为危害养禽业的必须报告的疫病,因此世界各国对本病的发生和流行均高度重视,在许多发达国家已消灭了本病。新城疫病毒(NDV)只有一种血清型,但不同毒株之间的毒力和致病性差异很大。在世界上曾有过三次大流行,其中两次源于鹦鹉和鸽,其它禽类由来的NDV在易感动物鸡体中连续传代后毒力增强的可能性很高。我们在前期研究工作中进行了NDV无毒株在鸡体内传代的工作,即将从野生水禽的新鲜粪便中分离得到的无毒株Goose/Alaska/415/91经9代次的雏鸡气囊接种传代(9a)和5代次雏鸡脑内接种传代(5b),分析每次传代后分离株的毒力和分子结构变化,结果表明无毒株演变成了强毒株。F蛋白的基因序列分析结果表明,原代病毒无毒株的F蛋白裂解部位112-117位氨基酸序列具有典型的弱毒株模式,即ERQER-L,而经过14次的传代则演化成典型的强毒特征,即KRQKR-F。最近的研究表明:HN基因也被认为在NDV感染过程中起着重要的作用。在根据NDV基因的核苷酸和氨基酸序列对NDV分离株进行致病性分类时发现HN和F基因的变异具有很强的正相关性。在我们的前期研究工作中重点是放在原代病毒和继代病毒的F蛋白裂解位点的突变株与致病性演化的关系上,结果表明:病毒在逐渐获得致病性的同时,F蛋白基因发生着相应的变异。而HN基因的变异与NDV致病性的关系以及HN蛋白的变异规律正是本实验的研究重点。本实验以原代病毒及其继代共15代次病毒为研究材料,进行部分生物学活性的检测,针对实验获得的15个NDV HN全基因的克隆进行测序与氨基酸序列的分析,研究HN基因的变异规律,对于NDV的致病性分子基础提出新的理论依据。在实验中将15代NDV分离株分别接种鸡胚尿囊液进行增殖病毒,提取病毒基因组总RNA,进行RT-PCR扩增HN基因,克隆入pGEM-T载体后,经蓝白斑筛选,酶切鉴定,阳性克隆进行测序分析。经过序列比对分析15代分离株的HN基因发现:经过在气囊传两代后,自2a(气囊传代2次)代起HN蛋白1717位碱基G突变为T,导致终止密码子由1864TAA1866提前至1717TAG1719,这使得HN蛋白从616个氨基酸(aa)缩减为572aa,即少了一个44aa的尾,且一直保持到9a5b(气囊传代9次,再在脑内传代5次)代病毒。HN蛋白中糖基化位点、参与蛋白二聚体形成的半胱氨酸残基均未发生改变。实验结果表明,HN蛋白只要在气囊传代2次,就能达到生物学活性的变化,即经过气囊传代后,原代无毒株的致病基因序列发生有义突变,而这种突变是发生在转录水平而不是翻译水平上的。也许可能HN终止子突变是NDV毒力增强的必要条件,与致病性密切相关的这种结构蛋白的序列改变极可能是在F蛋白裂解位点突变前NDV毒力增强的主要原因,HN蛋白基因的突变所致的毒力增强先于F蛋白,是NDV毒力变化的先导。