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背景:在世界范围内,乳腺癌已经成为女性的最常见恶性肿瘤。乳腺癌细胞表面高表达人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2,HER2）,其与乳腺癌患者的不良预后密切相关。赫赛汀是一种人源化的靶向HER2的免疫球蛋白G1（immunoglobulin G1,IgG1）型单克隆抗体,临床上已作为一线药物用于HER2阳性的乳腺癌患者的治疗。在实际应用中,虽然赫赛汀与化疗方案联合,可以有效提高病情缓解率,延长肿瘤进展时间以及患者生存期,但赫赛汀相关心脏毒性,以及易产生耐药抵抗现象,限制了其临床应用。现今,自然杀伤细胞（natural killer cell,NK cell）治疗已经逐渐成为临床上极具潜力的免疫治疗方案。我们前期研究发现白细胞介素-2（interlukin-2,IL-2）和IL-15的细胞因子组合方案可以成功地在体外扩增NK细胞,但对于NK细胞杀伤活性的提高效果不明显。近来有文献指出,在体外对淋巴细胞应用赫赛汀进行刺激,可使淋巴细胞具有更强的杀伤效能。目的:本研究在现今已成熟的NK细胞培养体系中加入了赫赛汀,观察其对NK细胞的扩增、杀伤、迁移及粘附能力的影响及其相关机制,并在临床开展试验性治疗观察其安全性和有效性。方法:临床采集20例乳腺癌患者的外周富集血,分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,加入到提前用赫赛汀（实验组）,或IgG1（同型对照组）包被的培养瓶中,用IL-2与IL-15细胞因子联合培养方案在体外进行15天连续培养。培养结束后用磁珠分选的方法纯化扩增产物中的NK细胞以进行后续实验。在初始以及第15天计数培养体系中细胞总数。分别在培养的第0天,第5天,第10天,第15天应用流式细胞术,标记NK细胞,测定体系中CD3-CD56+NK细胞占总扩增产物中的百分比,并圈定CD56dimNK细胞与CD56brightNK细胞并分析其比例。在第15天将NK细胞分别与HER2阳性或阴性的乳腺癌细胞进行共培养,检测乳腺癌细胞中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的释放水平、NK细胞表面CD107a脱颗粒水平和干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）的分泌量,以评价纯化的NK细胞在体外对乳腺癌细胞的杀伤能力。利用活细胞工作站在显微镜下动态观察不同培养方案扩增出的NK细胞与乳腺癌细胞共培养时的相互作用;用趋化因子芯片检测用不同培养方案扩增出的NK细胞与乳腺癌细胞共培养后上清液中多种趋化因子水平。在培养的第0天,第5天,第10天及第15天测定NK细胞细胞表面活化受体NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D和DNAM-1表达水平和表面分子CD16表达水平,以及用二抗检测赫赛汀和IgG1的残留情况;用蛋白质印迹法（western blotting,WB）检测赫赛汀对NK细胞上CD16下游传导通路上关键蛋白表达及活化水平,如SYK、PI3K、VAV、RAC、ERK。最后对6例乳腺癌患者进行用赫赛汀修饰的NK细胞（Herceptin-armed NK cells,HA-NKs）的试验性治疗,初步观察临床安全性和有效性。结果:体外大规模培养15天后,赫赛汀组的总扩增产物的细胞数为（1.15±0.30×109）,与IgG组（0.90±0.41×109,p=0.06）和空白组（1.06±0.50×109,p=0.40）相比未见显著性差异。与空白对照组（43.00±13.66%,18.57±14.99×107,p<0.0001）和同型对照组（55.47±12.75%,22.22±19.47×107,p<0.0001）相比,赫赛汀可提高扩增产物中NK细胞扩增的比例以及数量（65.71±16.72%,29.26±19.38×107）。分析扩增产物中CD56brightNK细胞亚群的比例发现,与初始PBMC相比,赫赛汀可显著扩增总产物中CD56dimNK细胞亚群（5.00±1.12倍）,明显高于空白对照组（1.61±0.43倍,p=0.01）和同型对照组（2.47±1.15倍,p=0.02）。经赫赛汀刺激扩增的NK细胞对HER2阳性的乳腺癌细胞杀伤效率为（60.00±20.10%）,明显高于同型对照组（41.15±14.40%,p<0.0001）和空白对照组（38.95±14.10%,p<0.0001）,但对于HER2阴性乳腺癌细胞,赫赛汀实验组杀伤效率为（43.10±24.14%）,与同型对照组（28.65±9.56%,p=0.18）和空白对照组（35.11±21.90%,p=0.41）相比未见显著性差异,且从CD107a表达和IFN-γ分泌这两方面也获得一致结果,提示赫赛汀可刺激NK细胞的杀伤功能显著提高;活细胞工作站观察赫赛汀刺激NK细胞与HER2阳性乳腺癌细胞共培养时,NK细胞不断改变形态,迅速向肿瘤细胞移动,与肿瘤细胞的粘附数量增多,而与HER2阴性乳腺癌细胞共培养时未见此现象。趋化因子芯片分析显示,当赫赛汀修饰的NK细胞与HER2阳性乳腺癌细胞共培养时,上清中多种趋化因子,如单核细胞趋化蛋白（monocyte chemotactic protein,MCP）分泌水平增加。培养第15天时,NK细胞表面的多种活化受体,如NKp30、NKp44,NKp46,DNAM-1,NKG2D显著升高,但在赫赛汀组、空白组、IgG对照组之间表达无差异。赫赛汀实验组的NK细胞表面的CD16表达水平（33.01±15.93%）与空白对照组（66.56±11.79%,p=0.0046）相比显著下降,抗体存留检测发现CD16被赫赛汀持续占据,提示可能在与HER2阳性乳腺癌细胞共培养过程中发挥了NK细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）;蛋白电泳发现赫赛汀可刺激CD16下游的PI3K、VAV、RAC、ERK等蛋白持续活化,给予赫赛汀重复刺激,上述蛋白磷酸化水平可再次上调,从而促进NK细胞的体外扩增和活化。临床上将6例乳腺癌患者PBMC在体外进行赫赛汀刺激NK扩增的体内回输试验,无不良反应,所有患者耐受良好。对其中一例患者进行四次HA-NKs回输后进行影像学评价,发现肺部转移阴影缩小超过50%,达到部分缓解（PR）标准。结论:赫赛汀可提高总扩增产物中NK细胞比例以及数量,尤其提高了CD56dimNK细胞百分比。赫赛汀增加NK细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤能力,增强其变形及迁移能力。赫赛汀对NK细胞杀伤能力的增强与NK细胞表面多种活化受体无关,而与CD16被赫赛汀长时间的占据持续激活CD16相关。CD16被下游信号通路,导致PI3K、VAV、RAC、ERK磷酸化,促进NK细胞迁移及杀伤。临床试验性治疗效果初步证明这了种新型的NK细胞治疗方案的临床安全性和有效性,为HER2阳性乳腺癌患者提供一种新的治疗途径。