新型鹅星状病毒的分离鉴定及卵黄抗体的制备与应用

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hejunfeng206
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自2017年2月以来,在我国山东、江苏等地的雏鹅暴发了以痛风为主要特征的急性传染病,给我国养鹅业带来巨大的经济损失,病原分离鉴定结果表明导致该病发生的病原为新型鹅星状病毒。该病主要侵害20日龄以内雏鹅,死亡率可以达到50%以上。患病雏鹅主要以内脏器官及关节腔发生严重尿酸盐沉积为病理特征。发病雏鹅精神不振、卧地倦动、采食困难、生长迟缓,料肉比升高,肉鹅出栏合格率显著降低。卵黄抗体是鸡卵黄中的一种免疫球蛋白,特指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体。与血清抗体相比,卵黄抗体具有良好的稳定性、耐热性、耐酸性,在常温下仍能保持一定的活性。卵黄抗体安全、高效、无残留且温和环保,治疗效果明显,特异性强,可适合大规模生产。本研究从临床疑似患病样品中分离出7株新型鹅星状病毒,对分离株进行鉴定分析,选取优势毒株制备油乳剂灭活疫苗,免疫蛋鸡制备卵黄抗体,并进行临床应用研究,旨在为新型鹅星状病毒的预防与治疗提供技术支持。1.新型鹅星状病毒的分离与鉴定对本实验室2019~2020年采集的部分疑似感染样品进行新型鹅星状病毒的分离与鉴定,并对分离株进行动物回归试验。结果,共分离得到7株新型鹅星状病毒分离株,7株病毒核苷酸同源性在96.1%~99.9%之间。分离株测序分析结果显示,与经典毒株SDPY株核苷酸同源性在96.4%~99.0%之间,并在遗传进化树的同一分支上,表明分离毒株未发生明显变异。分离株与经典火鸡源、鸭源、鸡源星状病毒处于不同分支,亲缘关系较远。分离株JLCC株与SDPY株亲缘关系较近,根据其致病性及免疫原性分析,筛选出JLCC株作为疫苗株并进行动物回归试验。1日龄雏鹅静脉注射1.0m L(TCID50=10-3.22/0.1m L)病毒液后,雏鹅出现精神沉郁,卧地倦动、采食下降等临床症状,死亡雏鹅心脏、肝脏表面有尿酸盐附着、沉积,肾脏肿大、出血呈花斑状,输尿管有尿酸盐沉积等病理变化。2.新型鹅星状病毒灭活疫苗的制备将JLCC株接种鸡胚肝脏细胞扩增病毒。将抗原液经甲醛灭活(期间每隔6~8h摇匀一次)后,与吐温-80按96:4的比例混合制备为水相,将油相与水相按比例乳化,制备新型鹅星状病毒油乳剂灭活疫苗,并检验疫苗的物理性状。结果表明抗原液最佳灭活条件为终浓度为1.0‰的甲醛37°C灭活24h,理化性状检验结果表明,该疫苗为油包水型,离心稳定性良好,未见细菌、霉菌及支原体等微生物污染。3.新型鹅星状病毒卵黄抗体的制备使用制备的油乳剂灭活疫苗免疫蛋鸡,第四次免疫后14d收集高免蛋,使用间接ELISA方法检测卵黄抗体效价并制备提取卵黄抗体。对提取的卵黄抗体进行物理性状检验、安全性检验、雏鹅预防保护效果检验以及评估雏鹅攻毒后治疗效果。结果表明,在第四次免疫蛋鸡后,卵黄抗体效价为1:1024,提纯后卵黄抗体效价为1:512,理化性质及安全性检验结果显示,该抗体为淡黄色澄清透明液体,久置含有少量白色沉淀,未见细菌及支原体等微生物污染。抗体安全性良好,1日龄雏鹅颈部皮下注射1.0m L,未出现局部红肿和全身性不良反应。ELISA检测结果表明,当雏鹅体内抗体OD450值达到0.8及以上时,即可对新型鹅星状病毒的感染起到有效的预防作用。1日龄抗体注射后,雏鹅特异性抗体在1dpi开始上升,在注射后3d达到峰值之后开始下降,但依然维持较高水平。同时对雏鹅进行攻毒治疗试验,结果表明:在雏鹅自然带毒情况下,于1日龄和7日龄分别注射一次卵黄抗体,雏鹅的排毒期最短、生存率高、体重增长速度快,治疗效果最好。综上所述,本研究制备的新型鹅星状病毒卵黄抗体具有良好的免疫保护效果,且对带毒雏鹅具有较好的治疗效果,能够对N-GAst V的感染起到预防和治疗作用,为我国新型鹅星状病毒的预防与治疗提供一种快速、有效的新型生物制品,为雏鹅痛风病的综合防控提供技术支持。
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