【摘 要】
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富含甘氨酸的RNA结合蛋白(Glycine rich RNA binding protein,GRP)是广泛存在于真核生物中的一类蛋白,是参与转录以及转录后调控,影响多种代谢途径的重要蛋白。目前,对于这一类蛋白的研究主要集中在植物和动物上,其他物种中研究较少,丝状真菌中尚无研究。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻稻瘟病早已成为全世界水稻最严重的的病害之一。有关稻瘟病致病机
【基金项目】
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国家重大专项项目和“111”引智项目;
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富含甘氨酸的RNA结合蛋白(Glycine rich RNA binding protein,GRP)是广泛存在于真核生物中的一类蛋白,是参与转录以及转录后调控,影响多种代谢途径的重要蛋白。目前,对于这一类蛋白的研究主要集中在植物和动物上,其他物种中研究较少,丝状真菌中尚无研究。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻稻瘟病早已成为全世界水稻最严重的的病害之一。有关稻瘟病致病机理的研究将有助于深入了解病害的发生并建立有效的防治理论和技术。在本研究中,利用敲除于段对GRP相关基因在稻瘟菌生长发育和致病过程中的作用和机理展开了研究,得到了如下主要结果和结论。作者经过生物信息学等手段的分析确定了一个潜在的编码GRP蛋白的基因MGG07511,命名为MoGRP1。经过分子生物学手段获得了一个这一基因的敲除体,具体表型如下:MoGRP1基因敲除体不仅在菌丝生长上有明显的减慢,且在产孢和孢子发育过程中也出现缺陷,同时它的缺失还表现在附着胞形成率的降低并严重影响了菌株的致病能力。之后的互补实验确认了所有的表型都是由MoGRP1的缺失引起的。对野生型稻瘟菌的各阶段基因表达量的分析表明,MoGRP1呈现组成型表达特征并且在产孢阶段有着一定的表达量上调,约为菌丝阶段的4倍。作者为了弄清MoGRP1的参与稻瘟菌生长发育以及致病性的机理,对MoGRP1编码的蛋白进行了纯化以及互作蛋白的鉴定。利用蛋白质分子间互作研究方法—pull-down以及质谱分析,作者验证了两个与MoGrp1有强结合的蛋白,一个由MGG06457 基因编码的RNA前体剪切因子,命名为MoRse1;另一个是由MGG03556 基因编码的H/ACA核蛋白复合体组分1的蛋白,命名为MoGar1。通过免疫共沉淀来确证这一结果,作者提出MoGrp1可能伴随着MoRse1以及MoGar1参与前体RNA的转录后修饰过程。之后,进行的RNA结合实验又表明MoGrp1可以有效的结合poly(U)RNA并且不与DNA结合,暗示其可能和前体mRNA 的U富集区有结合活性。之后,我们观察发现MoGrp1蛋白能够稳定的定位于细胞核中。这一蛋白具有的甘氨酸富集的结构也是一类重要的结构域。作者以特征序列精氨酸-甘氨酸-甘氨酸(Arg-Gly-Gly,RGG)为节点,对敲除体进行了缺失互补。实验发现在缺失264位氨基酸之后不会影响蛋白正常行使功能;190位之后的氨基酸缺失导致互补体显示出与敲除体类似的缺陷,但能够部分互补敲除体的表型缺陷;181位氨基酸及其后续肽段的缺失导致完全不能恢复敲除体的表型。作者确定了 182-190位肽段在MoGrp1中最为重要,是MoGrp1行使全部功能的关键结构之一。此外,我们还对这些缺失互补体进行了亚细胞定位观察,发现190位氨基酸缺失后出现了部分的核定位不稳定;181位氨基酸缺失后核定位完全丧失。综上所述,本研究鉴定了稻瘟病菌一个新的致病基因MoGRP1,其编码产物为一个GRP蛋白,发现MoGRP1可以结合poly(U)RNA,暗示其可能通过对前体mRNA剪切修饰对某些致病必需基因进行转录调控,从而参与了稻瘟病菌的致病过程。此外,还发现MoGRP1能与前体mRNA剪切因子互作。作者还确定了富含甘氨酸的结构与RNA识别基序一样,都是MoGrp1的关键功能结构域。本研究为深入揭示稻瘟病菌的生长、发育和致病过程中的重要转录调控过程提供了重要新信息。
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