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目的:基因组不稳定是肿瘤的特征之一。DNA损伤应答(DDR)是预防基因组不稳定性的主要机制,也是影响细胞对电离辐射(IR)和许多化疗药物敏感性的重要因素。阐明DDR通路所涉及的分子调控机制对于理解肿瘤发生和干预肿瘤治疗具有重要意义。蛋白质棕榈酰化作为一种重要的蛋白翻译后修饰形式,可调控蛋白质的稳定性、转运及蛋白之间的相互作用等过程。近年研究发现棕榈酰化在恶性肿瘤的发生发展中起重要作用,但是其在基因组稳定性及DNA损伤修复机制中的功能尚不明确。Porcupine(PORCN)蛋白是膜结合的O-酰基转移酶,通常存在于内质网膜。本论文研究重点是阐明细胞核内的PORCN蛋白对DDR及肿瘤放射敏感性的调控机制。方法:为了探究细胞核内PORCN在DDR中的作用,首先采用慢病毒载体的PORCN sh RNA建立PORCN敲低的稳定细胞系。然后采用可以抵抗sh RNA敲低的PORCN-WT及PORCN-ΔNLS质粒转染细胞并建立PORCN突变的HT1080稳定细胞系。通过克隆形成实验检测细胞的放射敏感性,MTS实验检测细胞的增殖能力,免疫荧光实验检测细胞核内DNA损伤修复蛋白γ-H2AX的表达变化。通过DNA损伤修复检测系统,对细胞非同源重组修复(Non-homologous End Joining,NHEJ)及同源重组修复(Homologous Recombination,HR)的能力进行评估。通过对PORCN免疫沉淀物进行质谱分析筛选出PORCN相互作用蛋白。采用酰基-生物素置换法检测蛋白质的棕榈酰化水平。为了研究棕榈酰化的功能,将Ku70蛋白棕榈酰化位点由半胱氨酸突变成丝氨酸,并检测了这些突变体在HT1080细胞中的棕榈酰化能力。我们采用免疫共沉淀实验探究Ku70蛋白的棕榈酰化是否影响DNA-PKcs/Ku70/Ku80复合物的形成。为了研究电离辐射诱导的棕榈酰化在体内的活性,我们采用突变Ku70蛋白棕榈酰化位点的细胞建立小鼠移植瘤模型,并观察小鼠移植瘤经过电离辐射后的生长情况。结果:我们发现PORCN缺失的细胞表现为DDR异常,如γ-H2AX灶点持续时间延长,有丝分裂期尚未完成DNA损伤修复,同时NHEJ修复功能缺失,并且这些细胞的放射敏感性增加,说明PORCN参与了DDR及放射敏感性的调控。进一步研究结果发现有一小部分PORCN存在于细胞核中,第230-235位的KKRKAR氨基酸序列是核定位序列(Nuclear localization sequence,NLS)。这段NLS序列可影响PORCN蛋白的入核。通过激光共聚焦观察发现当去除这段核定序列后,细胞在有丝分裂期有γ-H2AX灶点的积累,表明存在有丝分裂期DDR功能障碍。通过DNA损伤修复检测系统发现与野生型细胞相比,PORCN-ΔNLS细胞的NHEJ修复缺失,但HR功能不受影响。克隆形成实验结果显示与野生型细胞相比,PORCN-ΔNLS细胞的放射敏感性增加。γ-H2AX免疫荧光结果示与野生型细胞相比,PORCN-ΔNLS细胞经过电离辐射后细胞核内γ-H2AX灶点持续时间延长,表明存在DNA损伤修复的延迟。荷瘤鼠实验发现PORCN-ΔNLS组相比PORCN-WT组放射敏感性增加。质谱分析发现PORCN可以与许多DNA损伤修复相关蛋白相结合,包括DNA-PKcs/Ku70/Ku80复合物。进一步实验发现PORCN可以介导Ku70蛋白棕榈酰化,这个过程依赖于PORCN的核定位序列。所有Ku70突变体的棕榈酰化水平均有不同程度的降低,只有将所有的半胱氨酸突变成丝氨酸(Ku70-MU)才失去棕榈酰化。克隆形成实验结果显示与野生型细胞相比,Ku70-MU细胞的放射敏感性增加。免疫荧光结果显示与野生型细胞相比,Ku70-MU细胞经过电离辐射后存在DNA损伤修复的延迟。DNA损伤修复检测系统发现与野生型细胞相比,Ku70-MU细胞的的NHEJ修复缺失,但HR功能不受影响。激光共聚焦观察发现Ku70-MU细胞经过电离辐射后在有丝分裂期有γ-H2AX灶点的积累,表明存在有丝分裂期DDR功能障碍。免疫共沉淀实验发现与野生型的Ku70蛋白相比,突变棕榈酰化位点后的Ku70蛋白与Ku80蛋白的结合减弱,且不能与DNA-PKcs蛋白结合。进一步荷瘤鼠实验发现Ku70-MU组相比Ku70-WT组放射敏感性增加。结论:有部分PORCN蛋白在细胞核内表达,且细胞核内的PORCN可介导Ku70蛋白的棕榈酰化。Ku70蛋白的棕榈酰化在DDR中起重要作用,其机制为Ku70蛋白的棕榈酰化可影响DNA-PKcs/Ku70/Ku80复合物的形成进而影响NHEJ。综上所述,我们的研究阐明了PORCN依赖的Ku70蛋白棕榈酰化在DDR中的关键作用。