论文部分内容阅读
第一部分基于深度测序从全基因组分析母子患者血清HBV准种多态性目的：通过建立一种快速、高通量的方法，能够同时对多个样本进行全基因组深度测序，对母子患者血清乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus, HBV）病毒准种进行全基因组重测序，从病毒全基因组水平上了解不同患者或同一患者体内HBV准种多态性分布特征，分析母子患者体内HBV准种分布的同源性与差异性，为下一步进行疫苗逃逸位点的发现与鉴定提供依据。方法：1、制备HBV全基因组序列：以4对母子患者血清HBV病毒颗粒为模板，PCR扩增HBV3.2kb全长DNA。2、构建solexa测序文库：（1）使用Nextera Technology将HBV DNA的全基因组片段化，处理成5’端带转座末端序列的小片段。（2）设计Barcode引物，在转座末端序列的5’端加上Barcode序列，通过PCR给每个样本加上标签。（3）胶回收250bp~500bp的目的片段。（4）通过克隆测序验证上述构建的测序文库。3、将所有样本等量混合后进行两次solexa测序。4、对测序数据进行生物信息学分析：构建consensus序列，利用Barcode序列对测序数据进行分库（分库标准：与barcode序列5’端去掉2个碱基后的序列完全一致），通过和consensus序列对比过滤低质量数据（过滤标准：Filtered：Reads N>3，Poly N>15，测序质量值<30；Low P-score：HBV同源性<90%），通过分析测序误差、coverage分布情况、香农熵分布情况等参数，评估实验方法的可行性和重复性；同时进一步比较采用不同PCR扩增方案得到HBV全基因组序列和不同酶浓度处理的HBV全长序列的测序数据的异同，最后分析了母子患者体内病毒准种的同源性和差异。结果：1、分库，过滤低质量序列后，两次测序获得有用序列的效率分别是30.53%和44.88%，平均每个位点的测序深度分别是1043和2733个碱基。测序误差分别是0.26%和0.23%，所有样本均能够100%覆盖HBV全基因组。所有样本的coverage分布均表现为相同的规律，在nt900、nt1800和nt2500区域表现为低覆盖。每个样本两次测序在coverage分布的比较上没有差别（P<0.05），但在香农熵的分布比较上，11个样本中有3个样本两次测序有一定差异。2、不同PCR扩增方案获得HBV全长序列测序得到的数据和不同酶浓度处理的HBV全长序列测序后得到的数据在coverage分布的比较上没有明显差异（P<0.05），但在香农熵分布的比较上，第一次测序有差异，第二次测序没有差异（P<0.05）。3、母子间准种序列的相对香农熵分布可以聚类，非母子间不能聚类。但是母子间序列在S抗原的A决定簇区域和P、C、X基因的抗原表位的区域具有差异。结论：1、结合Barcode标签，我们建立了一种高通量的对HBV全基因组进行分析的策略方法，有助于深入分析HBV准种序列特征。2、结合上述技术，我们对临床乙肝病毒感染的4对母子样本进行了准种分析，发现不同患者和同一患者体内HBV准种分布具有多态性，并且获得了患者体内HBV准种的序列在每个核苷酸位点上的频谱。3、通过对母子患者体内HBV准种全基因组频谱的聚类分析，我们发现母子患者体内的HBV准种的相似性高，而非母子患者体内的HBV准种的相似性低，从而推测子代患者体内的HBV准种来自母亲，即HBV的传播是以垂直传播为主的。4、分析母子患者体内的HBV准种全基因组频谱的差异性，我们发现，这些差异性位点多位于HBV疫苗作用的S抗原的A决定簇区域或抗原表位区域，这为下一步对疫苗逃逸位点的发现和鉴定提供了依据。第二部分HBV DNA线性结构与环化结构在转染Huh7细胞后HBV复制水平差异的研究目的：通过比较不同乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）体外复制体系中分泌的乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）、乙型肝炎病毒e抗原（hepatitis B e antigen, HBeAg）和病毒颗粒的复制水平，表明采用环化策略的HBV体外复制体系更适合HBV反转录调控的分子机制研究。方法：1、选择已经构建好的3种质粒：（1）由CMV启动的HBV1.1倍体质粒（CMV-HBV1.1）；（2）由CMV启动的HBV1.3倍体质粒（CMV-HBV1.3）；（3）由T载体上的启动子启动的HBV1.3倍体质粒（T-vector-HBV1.3）。2、任选一个质粒用含有BspQI内切酶位点的引物扩增HBV全长（本实验选择了CMV-HBV1.1）。使用BspQI限制性内切酶酶切，然后用T4DNA连接酶连接，构建环化HBV DNA（cyclized-HBV）。3、将三种质粒和环化的HBV DNA转染到Huh7细胞中，5天后收集细胞上清进行ELISA分析，收集细胞并提取HBV复制中间体DNA进行Southern印迹分析。结果：1、成功扩增HBV全长片段并构建了环化HBV DNA；2、转染Huh7细胞后，ELISA检测乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis Bsurface antigen, HBsAg）和乙型肝炎病毒e抗原（hepatitis B e antigen,HBeAg）均为阳性结果；3、从Huh7细胞中提取HBV复制中间体并做Southern印迹分析得到阳性结果。结论：HBV DNA全长通过环化连接后转染Huh7细胞，可有效的观察其复制表达，并且HBV DNA环状结构的复制表达能力优于HBV线性结构的表达质粒。