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丹皮酚(Paeonol,Pae)又称牡丹酚,是毛茛科植物牡丹Paeonia Suffruticosa Andr根皮和萝摩科植物徐长卿Pycnostelma Paniculatum(Bunge)K Schum干燥根或全草的主要有效成分。Pae是一种小分子的酚类化合物,呈白色有光泽的针状结晶,具有熔点低(mp51℃±1℃)、易挥发及水溶性差的特性,其分子量为166.18,分子式为C9H10O3,化学名为2-羟基-4甲氧基苯乙酮。有关Pae的药理活性国内外诸多学者进行了研究。业已研究表明,Pae具有解热镇痛、镇静催眠、抗炎抗菌、抗动脉粥样硬化、抑制血小板聚集以及增强细胞免疫功能和抗氧化作用。同时大量体内外实验研究证明, Pae能抑制多种肿瘤的生长,包括人红细胞白血病细胞系K562、人乳腺癌基因细胞系T6-17及肝癌细胞系BEL-7404,但在食管癌领域,尚未研究报道。本研究采用人食管癌Eca-109细胞分别和不同浓度的Pae进行培养,选用MTT法检测Pae对体外培养人食管癌Eca-109细胞的抑制增殖作用。建立人Eca-109食管癌裸鼠皮下移植瘤模型,随机将裸鼠分成7组,对照组、Pae不同剂量组(25、50、100、200 mg/kg)、顺铂对照组(CDDP,剂量5 mg/kg)以及联合组(Pae 100 mg/kg+CDDP 5mg/kg),所有组别给药时间为2周,计算药物抑瘤率。采用光镜及电镜观察各组的肿瘤组织的形态学变化。用TUNEL及S-P免疫组化法检测各组肿瘤组织,并比较各组肿瘤组织中凋亡指数及Bcl-2/Bax和caspase-3的表达,初步探讨Pae对人食管癌Eca-109生长的影响及其部分机制。1. Pae对人食管癌细胞Eca-109的增殖抑制作用选用人食管癌Eca-109细胞,采用MTT法检测了Pae体外抑制人食管癌Eca-109的抑制增殖作用。结果显示:Pae在0.047～1.504 mmol/L对人食管癌Eca-109细胞的生长有抑制作用,抑制率随着药物的浓度升高而升高,呈现明显的剂量效应关系。Pae在0.094～1.504 mmol/L对Eca-109细胞的抑制率为12.28%～89.98%。以药物浓度的对数与抑制率进行直线相关分析,r=0.964,P<0.01,得出IC50值为0.342 mmol/L。2. Pae对人Eca-109食管癌裸鼠移植瘤的抑制作用2.1 Pae单药对人Eca-109食管癌裸鼠移植瘤生长影响的动物体内观察Pae灌胃给药对人Eca-109食管癌裸鼠移植瘤的生长有明显的抑制作用。Pae在25 mg/kg剂量时抑瘤率为10.67%,与对照组相比无显著性差异。Pae在50 mg/kg,100 mg/kg及200 mg/kg剂量时抑瘤率分别为23.54%,27.91%和34.46%,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。由此可见,一定剂量的Pae对人Eca-109食管癌裸鼠移植瘤有抑制生长作用,且抑瘤率随着剂量的增加而逐渐上升,呈剂量依赖关系,以药物剂量的对数与抑制率进行直线相关分析,r=0.974,P<0.05。2.2 Pae联合CDDP对人Eca-109食管癌裸鼠移植瘤生长影响的动物体内观察Pae单药在100 mg/kg剂量下抑瘤率为27.91%。CDDP单药在5mg/kg剂量下抑瘤率为58.71%。Pae与CDDP联合用药抑瘤率达到77.91%。采用CDI分析药物相互作用性质,结果发现,两药合用具有协同作用。3.Pae诱导人Eca-109食管癌裸鼠移植瘤的细胞凋亡3.1 Pae诱导人Eca-109食管癌裸鼠移植瘤的细胞凋亡的形态学观察采用苏木素伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色,光镜下细胞的形态学观察。结果发现,与对照组相比,用药组肿瘤组织中可见肿瘤细胞数量减少,部分细胞见核染色质边集,核内出现空泡,核固缩、核碎裂,即明显的凋亡细胞,但多散在分布,坏死灶不多。采用透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察,结果发现肿瘤细胞核染色质浓缩边聚、胞浆浓缩、核碎裂以及凋亡小体形成等典型的凋亡表现。3.2 TUNEL检测人Eca-109食管癌裸鼠移植瘤的细胞凋亡选用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)方法,检测肿瘤组织的细胞凋亡。采用凋亡指数分析凋亡细胞百分比。结果发现,对照组有少许细胞核深染为棕褐色的凋亡细胞,用药组凋亡细胞明显多于对照组。用药组凋亡指数与对照组相比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。4.Pae诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡的可能分子机制采用免疫组化S-P法分别检测人Eca-109食管癌裸鼠移植瘤Bcl-2/Bax以及caspase-3的表达。采用生物图像分析系统软件分析结果,发现Pae可抑制Bcl-2的表达,其增强Bax的表达,且随着药物剂量的增加Bcl-2/Bax的比值降低。Caspase-3的表达随着Pae药物剂量的增加而加强。结果提示,Pae诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡可能与调节Bcl-2、Bax以及caspase-3表达有关。5.结论本研究结果提示:Pae在体内外具有抑制人食管癌Eca-109细胞增殖,并且在体内可有协同CDDP的作用。Pae能够诱导细胞凋亡,其诱导凋亡的机制可能与下调Bcl-2/Bax比值及激活caspase-3有关。