前言:　　 雄黄(Realgar),系硫化物类矿物雄黄族雄黄的矿石,味辛、温,有毒,归心,肝,胃经,用于解毒杀虫,燥湿,去痰,截疟等。在现行四大国家标准收载的全部中药制剂中,含雄黄的制剂多达2.80%(194/6938)。同时雄黄也是《医疗用药毒性药品管理办法》特别规定的28种毒性中药之一。近年长期、超量和不规范使用单味雄黄或其复方制剂引起不良反应或慢性砷中毒事件时有报道,其中不少是新生儿、少儿滥用所致,因而雄黄对人体健康的影响成为了人们近年来关注的焦点。雄黄主要成分为二硫化二砷(As2S2)或四硫化四砷(As4S4),含有少量As2O3[iAs(Ⅱ),即砒霜]和As2O5[iAs(Ⅴ)]。无机砷在体内经过氧化甲基化和还原,可产生多种甲基化代谢产物[—甲基胂酸(monomethyl-arsenicacid,MMA),二甲基胂酸(di-methylarsenicacid,DMA)等],其中MMA(Ⅲ)的急性毒性最强,是iAs(Ⅲ)的4倍,这些代谢产物随血液分布到全身各组织器官或系统,造成机体损伤。流行病学调查显示长期暴露砷的儿童注意力、语言能力和长期记忆力均下降。动物实验表明,砷是一种发育毒物,可通过血脑屏障进入脑组织并蓄积,导致实验动物的智力和认知能力等学习和记忆方面的障碍。因此,阐明雄黄损害学习记忆功能及其毒作用机制对于早期采取有效措施保护少年儿童健康具有重要的经济和社会意义。　　 材料与方法:　　 中国医科大学实验动物部提供4周龄Wistar大鼠64只,体重50±10g,雌雄各半,正式实验前适应性饲养1周,按体重随机分成8组,每组8只,以0.5%CMC-Na水溶液为混悬介质,1-2组为低剂量组灌胃给药剂量为0.3g/kg,第3-4组为中剂量组给药剂量为0.9g/kg,第5-6组为高剂量组给药剂量为2.7g/kg,7-8组为对照组(0.5%CMC-Na水溶液),每个剂量组内的2个小组分别饲养2、6周。每日1次,在动物灌胃期间每3天称重1次,调节灌胃剂量。所有动物均自由饮水和进食普通饲料。最后一次灌胃2h后,10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,迅速开颅取大脑待用(冰浴下进行)。　　 第一部分实验:采用冷阱捕集.氢化物发生.原子吸收法测定雄黄染毒2周大鼠脑组织中形态砷的含量,雄黄染毒6周大鼠脑组织和血中形态砷的含量。　　 第二部分实验:采用柱前衍生化-高效液相色谱紫外检测法测定雄黄染毒2周、6周后,大鼠脑组织中氨基酸类神经递质的含量及方法学考察。　　 结果:　　 在大鼠血液中检测到iAs、MMA和DMA,而脑组织中仅检测到MMA和DMA,未检测到iAs。雄黄灌胃2周和6周后,与对照组比较,各剂量组大鼠脑组织中MMA、DMA和Tas含量水平均显著增加(P<0.01,P<0.05)。比较染毒6周和2周大鼠脑组织中蓄积的砷量,发现6周大鼠脑组织中砷含量远远高于2周大鼠脑组织中的砷含量。实验结果提示雄黄代谢产物MMA和DMA可通过血脑屏障在脑组织中蓄积,脑中砷代谢速度较慢,并且脑中MMA、DMA和Tas的量随着雄黄染毒剂量的增加和染毒时间的延长而升高,说明长期服用雄黄易于引起慢性砷中毒。　　 实验表明,幼鼠连续染毒2周后,经统计分析发现高剂量雄黄染毒组大鼠脑组织中兴奋性氨基酸Asp含量与对照组比明显降低(P<0.05);但低剂量雄黄染毒组大鼠脑组织中抑制性氨基酸GABA和Tau含量明显高于对照组(P<0.05)。连续灌胃6周后,与对照组比较,Asp和Glu在雄黄染毒组大鼠脑组织中的含量均明显减少(P<0.05)。染毒组大鼠脑组织中抑制性氨基酸Gly含量减少,低剂量和高剂量组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);GABA在低、中剂量组含量低于对照组,差异无统计学意义;各染毒剂量组大鼠脑组织中Tau含量水平与对照组比也显著降低(P<0.05)。　　 比较染毒2周和染毒6周的实验结果发现,大鼠脑内Asp在染毒2周后高剂量组明显降低,染毒6周后低、中、高剂量组均明显降低(p<0.05);大鼠脑内Gly在染毒2周后,有降低趋势,染毒6周后各剂量组均明显降低(p<0.05);大鼠脑内Gly在染毒2周后,低、中剂量组含量均增加,但低剂量组有统计学意义,高剂量组的含量明显降低,染毒6周后各剂量组均明显降低(p<0.05);大鼠脑内GABA在染毒2周后,低剂量组含量增加(p<0.05),中、高剂量组的含量稍又降低,染毒6周后各剂量组均均降低,但没有统计学意义;大鼠脑内Tau在染毒2周后,低剂量组含量显著增加(p<0.05),中、高剂量组的含量虽有降低,但无统计学意义,染毒6周后各剂量组均明显降低(p<0.05)。灌胃2周后染毒组大鼠兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸平衡常数K与对照组比有降低趋势,但没有统计学差异;灌胃6周后,染毒组大鼠平衡常数K与对照组相比明显降低,差异有统计学意义,说明长期服用雄黄可引起氨基酸代谢平衡失调。　　 建立了柱前衍生化的HPLC法测定大鼠脑中5种氨基酸类神经递质含量的方法,经方法学考察该方法结果发现以pH9.5的碳酸盐为衍生化缓冲液,与0.2mL10mmol/L的丹磺酰氯在65℃反应25min的条件下各氨基酸的衍生化效率最大,该方法重复性、日间精密度良好。衍生化后的脑组织样品在12h内、3次冻融循环及-70。C条件下贮存20天后5种氨基酸均很稳定,其回收率在87.7%-107.2之间,表明该方法准确、灵敏、可靠、检出限低。　　 结论:　　 1、雄黄在大鼠体内的代谢产物为iAs、MMA和DMA,并且以DMA为主。其中MMA和DMA可以通过血脑屏障进入并蓄积脑中,并且脑中MMA、DMA和Tas的量随着雄黄染毒剂量的增加和时间的延长而升高。　　 2、雄黄染毒6周可使大鼠脑组织内兴奋性氨基酸类神经递质(Asp和Glu)及神经调质(Tau)水平明显降低,引起脑内氨基酸水平失调,产生神经系统毒性。　　 3、建立了柱前衍生化-高效液相色谱法同时检测5种氨基酸类神经递质的方法,方法准确、灵敏、可靠、检出限低。