论文部分内容阅读
脱氧核糖核酸(DNA)是生命遗传信息的载体。DNA分子的完整性和稳定性对于细胞的存活和正常的生命活动具有重要意义。DNA聚合酶β(Polβ)是碱基切除修复途径中的关键酶,在维持基因稳定性和完整性的过程中起着重要作用。PolβR137Q位点是将Polβ的第137位精氨酸替换成谷氨酰胺,实验室前期研究已经发现该位点突变会降低DNA碱基切除修复效率,而降低DNA碱基切除修复效率的分子机制目前还不清楚。本研究通过经典的基因打靶的方法成功获取了R137Q突变的转基因小鼠。我们研究发现,R137Q突变的纯合小鼠的出生率显著低于野生型对照小鼠,对孕鼠进行解剖后发现,R137Q小鼠E15.5,E17.5和E19.5天的胚胎体型和体重都显著低于野生型小鼠胚胎。免疫组化实验表明,R137Q小鼠胚胎增殖显著低于野生型小鼠。胚胎成纤维细胞(MEFs)的细胞生长曲线进一步证实了免疫组化实验的结果。我们对磷酸化细胞周期检验点蛋白pCHK1进行检测后发现,pCHK1在R137Q细胞中的表达量显著高于对照组,表明R137Q细胞周期检验点被激活。同时,TUNEL凋亡测定发现,R137Q细胞存在更高的凋亡比例。R137Q细胞增殖较慢并且凋亡增加同时细胞周期检验点被激活,而只有当细胞周期异常时检验点才会被激活,基于此我们观察DNA结构是否发生变化。通过核型分析发现,R137Q细胞内存在更多的染色体断裂。考虑到Polβ是碱基切除修复中的关键酶,Polβ位点突变可能会影响DNA碱基切除修复能力。于是我们采用组织裂解液和原代胚胎成纤维细胞裂解液来重构短片段碱基切除修复(SP-BER)和长片段碱基切除修复(LP-BER)过程。实验结果显示,与WT相比,R137Q小鼠的组织和细胞裂解液均不能有效修复DNA损伤,R1 37Q细胞BER修复效率明显降低,提示细胞内的DNA损伤修复系统出现障碍。伴随着R137Q细胞碱基切除修复效率的降低,细胞进行DNA修复时产生大量的DNA中间产物如DNA断裂,免疫印迹和免疫荧光实验结果显示R137Q细胞存在着更多的DNA双链断裂。我们之前体外的研究已经表明,R137位点的突变导致了Polβ聚合酶活性的降低和碱基切除修复效率的下降。该结果表明体内的R137Q突变影响了聚合酶活性和碱基切除效率,进而导致了DNA双链断裂和染色体异常。此外,我们通过烷化剂和氧化剂处理细胞来模拟正常生理条件下细胞所受的各类DNA损伤刺激。结果发现,当用MMS和双氧水分别处理纯合子的R137QMEFs,杂合子WT/R137Q MEFs和野生型WT MEFs之后,R137Q纯合子MEFs的生存率大大降低,磷酸化的组蛋白H2AX表达量显著增加,这一结果表明,R137Q突变增加了细胞对DNA损伤试剂的敏感性,诱发了更多的DNA损伤。综上,我们的实验通过R137Q的转基因小鼠,用体内的实验结果证明,R137是Polβ的关键位点,R突变成Q导致了Polβ功能受损,DNA修复能力下降以及基因组的不稳定,最终引起了细胞和小鼠整体的生理功能异常。我们的结果再次证实了Polβ结构和功能的完整性对于维持生物体正常生命活动的重要作用。本研究不仅有助于我们对于Polβ在肿瘤和其他相关疾病中作用机制的理解,同时为预防和治疗DNA修复相关疾病提供新的理论依据及新的靶点。