肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是目前临床上最常用的肝癌诊断血清标志物，其诊断的敏感性在39～64％之间，特异性在76～91％之间，这样的敏感性和特异性难以满足人们对肝癌诊断的要求，因此，迫切需要找到更理想的肝癌诊断标志物。　　 高尔基体蛋白73(Golgi protein73，GP73)是一种Ⅱ型高尔体跨膜糖蛋白，与肝炎、肝硬化和肝癌等肝病的发生、发展密切相关，GP73对肝癌诊断的灵敏度和特异性为65％和90％，而核心岩藻糖化GP73对肝癌诊断的灵敏度和特异性则高达90％和100％，GP73有可能成为一种更理想的肝癌临床诊断标志物，而核心岩藻糖化的GP73在肝癌的早期诊断中可能具有更重要的意义。本研究的目的就是要制备出特异性好、亲和力高的单克隆抗体，用于肝癌的早期诊断。　　 传统抗体制备方法需要全蛋白或合成肽作为抗原免疫动物，但是全蛋白往往不易得到，而且纯化过程费力、耗时；通过化学合成法合成抗原肽成本高，并且还需要与载体蛋白偶联。而本研究利用噬菌体展示技术将抗原表位展示于噬菌体表面，以该重组噬菌体作为替代抗原免疫动物来获得针对全蛋白的特异性单克隆抗体。　　 首先要进行抗原表位的选择。由于GP73蛋白的结构未知，没有其三维结构信息，因此不能根据其空间构象选择其潜在的B细胞表位。一般蛋白质的N末端和C末端肽具有较好的可及性，最有可能成为蛋白质的B细胞表位。血清GP73是由弗林蛋白酶在第55位氨基酸处酶切后释放到胞外的，所以，血清中的GP73具有一个与膜上GP73不同的N末端序列。我们选择这个新的N末端的一段序列作为候选表位；同时，由于GP73的C末端肽也具有较好的亲水性和可及性，并且在人蛋白质库中是唯一的，因此，将GP73的C末端的一段序列作为另一个候选表位，将两个表位分别命名为GP73N和GP73C。我们将这两个表位分别展示于T7噬菌体表面，从而获得了T7-GP73N和T7-GP73C重组噬菌体，即获得了替代抗原。　　 为筛选单克隆抗体的需要，我们还将选取的GP73N和GP73C两个表位编码序列克隆到到pGEX-4T-2载体中，以制备用于ELISA筛选的GST-表位肽融合蛋白。通过亲和纯化法制备了高纯度的GST-GP73N和GST-GP73C融合蛋白。同时，还构建了GST融合蛋白载体，表达了GP73部分蛋白和全蛋白以用于后续单克隆抗体的鉴定。　　 将T7-GP73N和T7-GP73C噬菌体免疫Balb/c小鼠，待小鼠血清抗体效价达到融合要求时进行细胞融合，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经HAT选择培养基筛选，间接ELISA筛选稳定分泌抗GST-GP73N和GST-GP73C融合蛋白的杂交瘤细胞，并采用有限稀释法进行亚克隆至阳性率为100％。最终我们得到了3株稳定分泌抗GST-GP73N的杂交瘤细胞株，分别命名为GP73N1、GP73N4和GP73N8。　　 经初步检测GP73N1亲和力较高，但是特异性稍差；GP73N4特异性较好，但是亲和力不高；GP73N8经鉴定亲和力和特异性都较好，并对GP73N8进行了系统鉴定。　　 ELISA实验结果显示，GP73N8单克隆抗体只与GST-GP73N小肽反应，与其他8种无关蛋白不反应；Western blot实验显示，该抗体仅与细胞裂解液中的GP73蛋白发生反应，与细胞中的其他蛋白均不发生反应，这说明GP73N8单克隆抗体具有较好的特异性，不仅能识别重组表达的GP73蛋白，而且能识别细胞中表达的GP73蛋白。　　 采用Sigma IsoQ5试纸条鉴定了抗体亚类，GP73N8为IgG1亚类抗体。　　 采用间接ELISA方法测定了GP73N8抗体的亲和常数，其亲和常数K值为3.36×107 L/mol。　　 细胞免疫荧光实验证实了GP73蛋白在HepG2细胞中定位在核周围，而高尔基体一般也是分布于细胞核周围，与GP73蛋白是高尔基体蛋白一致。　　 通过Western blot实验检测了GP73在不同肝癌细胞和其他癌细胞中的表达，从选择的几种肝癌细胞的裂解液来看，这几种肝癌细胞中均有GP73的表达；而在其他几种非肝癌的癌细胞中Raji和GLC-82细胞中GP73的表达量较高，Hela细胞中有少量表达，而LoVo和MCF-7细胞中检测不到GP73的存在，说明GP73并非肝癌细胞特异性表达蛋白。　　 利用GP73N8抗体和小扁豆凝集素配对，用生物芯片技术建立了检测血清核心岩藻糖GP73的实验方法。但实验结果并不理想，该方法尚需要进一步优化。　　 用GP73N8抗体检测了GP73在肝癌病人组织中的表达情况。从45例肝细胞癌、5例胆管癌和10例正常肝组织免疫组化实验结果看，GP73蛋白在Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级肝癌组织中的表达量有逐渐上升的趋势，而在正常肝组织和胆管癌组织中几乎看不到表达。　　 总之，本研究采用替代抗原策略，利用表面展示GP73抗原表位的重组T7噬菌体作抗原制备了针对GP73蛋白的抗体，该抗体能够特异性识别完整GP73蛋白，可用于ELISA、Western blot、免疫荧光和免疫组化分析。该抗体的制备为下一步研制GP73肝癌诊断试剂盒奠定了较好的基础。