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目的：肝癌具有隐匿性强、容易转移的特点,早期诊断比较困难。肝癌死亡率位居世界恶性肿瘤的第三位,治疗预后差、长期生存率低,是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一。由于肝癌的发病机制并不是十分明确,目前临床上还没有找到一种特别有效的根治方法,这促使人们去积极探索肝癌的发生机制、进一步研究肝癌细胞的生物学特性,以希望能够找到一种特异性的、疗效可靠的治疗方法。越来越多的科学研究表明,在肿瘤的恶性表型和生物学特性中起着决定性作用的往往是存在于肿瘤内的极小一部分细胞,该类细胞被称为“肿瘤干细胞”。本课题主要通过全自动磁性分选系统,从肝癌细胞系Huh-7中分离出EpCAM+细胞亚群和EpCAM-细胞亚群,研究EpCAM+细胞亚群在肝癌细胞系Huh-7中的肿瘤干细胞样特性,为进一步探索肝癌的特异性治疗靶点奠定基础。
方法：应用流式细胞术和Western blotting的方法检测肝癌细胞系Huh-7、SMMC7721、HepG2表面标志物EpCAM的阳性表达比率;从肝癌细胞系Huh-7中分离出EpCAM+细胞亚群和EpCAM-细胞亚群,比较两个细胞亚群的增殖、分化、克隆形成、迁移及耐药能力的差异;采用荧光半定量PCR和Western blotting的方法分别检测Sonic Hedgehog(SHH)和ATP结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette sub-family G member2,ABCG2)在两组细胞中的表达水平:将两组肿瘤细胞以不同的细胞数分别接种于BALB/C裸鼠体内,记录两组细胞的成瘤情况,评价两组细胞的成瘤性。
结果：流式结果显示,EpCAM在肝癌细胞系Huh-7、SMMC7721、HepG2中的阳性表达比率分别为13.3％、1.1%、0.4%。Western blotting结果表明,EpCAM在Huh-7细胞系中的蛋白表达水平最高,SMMC7721细胞系中次之,HepG2细胞系中最低。酶标仪检测分离后的EpCAM+细胞亚群培养第2、4、6和8天的光吸收度值(OD值)分别为0.195±0.011,0.315±0.017,0.396±0.018和0.577±0.013,均高于EpCAM-细胞亚群(P=0.019)。克隆形成实验显示,EpCAM+细胞亚群以50/皿、100/皿和200/皿的细胞密度将接种于平皿两周后,形成的克隆数分别为17±1.118、35±1.118、70±2.121,高于EpCAM-细胞亚群(P=0.001):EpCAM阳性表达比率培养至第8d时由99.5%下降至14.5%,与分选前的表达比率相接近。半定量PCR和Western blotting结果显示,SHH和ABCG2在EpCAM+细胞亚群中的表达量高于EpCAM-细胞亚群;Transwell迁移实验结果显示,同等条件下,EpCAM+细胞穿过膜的细胞数是EpCAM-细胞的1.8倍;将抗肿瘤药物顺铂加入肝癌细胞系Huh-7中培养,检测EpCAM+细胞亚群培养24、48、72小时的表达比率后发现,EpCAM+细胞亚群的表达比率随着培养时间的延长逐渐增加。将EpCAM+细胞以1×103个细胞数接种于BALB/C裸鼠体内,4周后就能形成肉眼可见的非常明显的肿瘤,而EpCAM-细胞在同等条件下,则需要接种1×105个细胞数才能形成肿瘤。
结论：与EpCAM-细胞相比,EpCAM+细胞亚群具有更强的增殖、分化、克隆形成、迁移、耐药及体内成瘤能力,具有肿瘤干细胞样特性,可以作为一个有价值的肝癌干细胞表面标志物用于分离纯化肝癌干细胞,为进一步探索肝癌的特异性治疗靶点奠定基础。