维生素K2是一种人体内不可缺少的重要维生素。微生物发酵法生产维生素K2的低得率、高成本一直是制约维生素K2生物法制备的瓶颈。黄杆菌属革兰氏阴性菌,细胞被膜作为细胞内外的渗透屏障,其狭窄的孔蛋白通道和低流动性的脂多糖可降低小的亲水性分子及亲脂性分子跨膜扩散的速度。维生素K2虽然是一种脂溶性维生素,但分子量较大,很难自由扩散跨膜转运,在胞内合成后主要结合在细胞膜上参与电子传递,很少分泌到胞外,胞内的不断积累不仅对细胞产生毒性,还会引起反馈抑制,限制产量,导致胞内维生素K2的产量较低。为了强化维生素K2的合成性能,以维生素K2的跨膜转运为切入点,通过物理化学协同调控方法改变细胞膜通透性,提高黄杆菌发酵产维生素K2的代谢通量,促进维生素K2的胞外分泌,从而提高其产量。并结合蛋白质组学和生物信息学分析,研究黄杆菌中维生素K2耐受性相关蛋白,揭示维生素K2的跨膜转运机制。取得结果如下:(1)以Flaavobacterium sp.CK为出发菌株,研究低能氮离子束、亚硝基胍和强磁场等诱变方法,通过复合诱变筛选得到高效诱变菌株Flavobacterium sp.N3-13,发酵合成胞内维生素K2产量较出发菌提高了121.4%,且具有良好的遗传稳定性。(2)研究了稳态磁场对Flavobatcrium sp.N3-13发酵过程的影响,发现中等磁场对黄杆菌具有阈值和时间窗效应。100 mT磁场强度下处理48 h后,生物量和维生素K2产量达到最大,与对照组相比分别提高了86.8%和71.3%。同时,中等磁场极大的改变了细胞的活力和形态,细胞变得更加细长,ATP和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)代谢更加旺盛。(3)研究了几种典型表面活性剂对Flavobacterium sp.N3-13的细胞活性、形态、细胞膜通透性和胞外分泌维生素K2的影响。Tween80、Triton X-100和POE(Polyoxyethylene 20 oleyl ether)三种表面活性剂均能促使维生素K2渗漏到胞外,提高维生素K2的产量,其中POE对促进维生素K2胞外分泌的潜力最大。Tween80属于非均质型表面活性剂,与细胞膜中流动的磷脂结合能力很弱,对细胞形态和细胞膜通透性影响不大;TritonX-100和POE属于均质型表面活性剂,与细胞膜中的磷脂分子发生互溶,使细胞膜发生皱缩甚至裂解,TritonX-100对N3-13细胞的毒性作用大于POE。结果表明,在N3-13发酵24 h时添加1.5%的POE和1%的TritonX-100,发酵8 d后测得维生素K2总产量为30.48±1.43 mg/L,比不加表面活性剂时提高了3 16.9%。其中胞外维生素K2的产量为23.68±1.09 mg/L。(4)研究了超声波对Flavobacterium sp.N3-13的菌体生长和发酵产维生素K2的影响。通过分析超声波对细胞活性和细胞膜通透性的影响,进一步优化了超声工艺条件。结果表明,N3-13发酵至40 h时在20 kHz和80%(×130 W)的条件下超声处理30 s,连续叠加2次超声,每次处理间隙时间为5s。发酵8 d后测得维生素K2总产量为31.44±1.08 mg/L,比未超声组提高了330.1%,其中胞外维生素K2的产量为25.74±0.92 mg/L。证实细胞膜通透性变化的主要机理是空化效应使黄杆菌细胞膜受损产生可逆性穿孔,从而提高细胞膜的通透性,促进维生素K2向胞外渗漏。(5)研究了超声和表面活性剂协同作用对Flavobacterium sp.N3-13合成维生素K2的影响。结果表明,低强度超声和POE协同处理时,改变了N3-13细胞的形态,提高了N3-13细胞的酯酶活性和细胞膜通透性并缓解了单独进行POE处理时对细胞膜的破坏作用,显著增加了胞外蛋白产量和胞外维生素K2产量。优化后的渗漏工艺条件为:将Flavobacterium sp.N3-13接种到添加0.87%POE的发酵培养基中,发酵到第40h时用20 kHz和83%(×130 W)的超声处理38 s,连续叠加2次超声,每次处理间隙时间为5s,胞外VK2产量达到42.09±0.97 mg/L。(6)通过iTTRAQ定量蛋白质组学方法,比较MK-4胁迫驯化得到的耐受菌Flavobacterium sp.r1 1和原始菌Flavobacterium sp.CK中蛋白质的相对表达含量,结合生物信息学分析筛选出以下显著差异表达蛋白:与物质转运相关的SusC/RagA家族TonB结合的外膜蛋白、TonB蛋白、TonB周质蛋白;与细胞代谢相关的细胞色素c氧化酶和EnvZ/OmpR双组分信号传导系统中AmpC、MprB、QseC、CcoN、CcoO、CcoP蛋白;与MK-4压力胁迫相关的PDI蛋白。这些蛋白的筛选鉴定为基因工程改造黄杆菌的细胞膜通透性、促进维生素K2的胞外分泌提供信息和生物靶标。