SCF泛素E3连接酶复合体(SKP1-Cullinl-F-box E3 ligase complex)是一种由三个核心蛋白组成的蛋白质复合体,包括一个底物识别F-box蛋白,一个铰链蛋白SKP1(S-phase kinase-associated protein1.)和能募集泛素结合酶E2的脚手架蛋白Cullinl(CUL1)。SCF泛素E3连接酶复合体通过F-box蛋白来识别和调控底物蛋白的稳定性,在各种生物学活动中发挥了重要的作用。SCF泛素E3连接酶是一个超家族,目前已经有70多个成员被报道。其中有一个亚家族由于含有FBA(F-box domain associate)结构域,因而能特异性识别糖蛋白。FBXO6为其家族成员之一。尽管FBXO6能识别糖蛋白,但是,具体FBXO6能识别哪些糖蛋白,其识别的糖蛋白是否都是其底物等等问题都暂不清楚。近年来,质谱技术在生命领域中的应用得到了迅猛的发展,利用质谱的高通量来系统性识别FBXO6的相互作用糖蛋白将有利于初步解决这些重要的问题。　　为了找到FBXO6的相互作用糖蛋白,我们分别在人宫颈癌细胞系HeLa、人胚肾细胞系293T和人淋巴细胞株瘤细胞Jurkat细胞中稳定表达带Flag标签的FBXO6(Flag-FBXO6)。随后利用Flag M2 beads在这些细胞系中进行了免疫沉淀实验。免疫沉淀得到的蛋白经过SDS-PAGE分离后,考马斯亮蓝染色。差异条带经割胶、酶解后由质谱鉴定。我们获得了FBXO6在三种细胞系中的相互作用蛋白库。经过比较这些蛋白库,我们一共获得了39个在三种细胞系里都和FBXO6结合的蛋白,我们称之为FBXO6相互作用核心蛋白,其中约有67％为糖蛋白。利用生物信息学(Gene Ontology)GO-分类研究,我们发现约有一半的蛋白为内质网蛋白。　　之前的研究表明,FBXO6识别糖蛋白靠其FBA区域,而在其区域中的2个点突变后(241,242 YW-AA),能消除其糖蛋白识别功能(FBXO6Null)。为了进一步了解FBXO6与哪些糖蛋白结合,我们在293T细胞里稳定表达了Flag-FBXO6Null。我们进一步比较了FBXO6WT和FBXO6Null的蛋白复合体组成,发现有140个蛋白特异性的结合FBXO6WT而不与FBXO6Null相互作用,而在这些蛋白中糖蛋白的比例占到了66％。我们接着比较了FBXO6核心蛋白和FBXO6WT特异结合蛋白(而不与FBXO6Null结合)的组成,发现核心蛋白有30个蛋白能特异性与FBXO6WT结合,其中29个蛋白为糖蛋白。我们随后用Western blot验证了结合的特异性,其中4个糖蛋白都只能和FBXO6WT发生相互作用而不与FBXO6Null结合。　　我们选取了一个糖蛋白ErolL为例,来研究FBXO6与这些糖蛋白的关系。我们发现ErolL特异性只和FBXO6结合,而不与其它9个F-box蛋白结合。利用糖苷酶Endo H和PNGase F,我们发现与FBXO6结合的ErolL都是糖基化形式。事先利用糖苷酶处理细胞裂解液后,FBXO6不能与非糖基化的ErolL发生相互作用。衣霉素能抑制糖链的生成,稳定表达Flag-FBXO6的293T细胞经过衣霉素处理后,ErolL出现了糖基化和非糖基化两种形式,而只有糖基化形式能和FBXO6相互作用。　　大量的研究显示SCF连接酶复合体参与到了细胞周期的调控。SCF复合体能识别并降解许多关键的细胞周期蛋白,并驱动细胞周期的进展。越来越多的研究发现,一些F-box(如SKP2)蛋白本身也被细胞周期所调控,然而,迄今为止,大部分F-box蛋白的功能还不清楚,是否有更多的新的F-box蛋白为细胞周期蛋白值得深入的研究。细胞周期由周期性的蛋白激酶以及周期蛋白调控,特别是在有丝分裂过程中,激酶的活性得到了大量的积累,为细胞分裂做好了准备。之前我们已经克隆了20多个N端带Flag标签的F-box蛋白,为了研究是否有新的F-box蛋白能受细胞周期调控,我们做了一个小规模的筛选,发现FBXO6在有丝分裂期能被特异性的磷酸化修饰。随后,我们在A549细胞里面,用FBXO6抗体检测内源性的FBXO6验证了该结果。的确,在我们之前的免疫沉淀质谱实验中,我们发现了一个磷酸激酶CDK1能与FBXO6相互作用。仅过表达或者敲除FBXO6对HeLa细胞的周期没有明显的影响。但有趣的是,FBXO6能加快同步化的HeLa有丝分裂期(M期)到G1期的转换。在同步化的细胞中,过表达FBXO6能突破有丝分裂检查点的限制,迫使细胞强行分裂,最终导致基因组不稳定性和细胞凋亡。进一步研究发现,FBXO6能特异性与有丝分裂检查点蛋白Mad2(mitotic arrest deficient2)和BubRl(Mitotic checkpointserine/threonine-protein kinase BUB1 beta)相互作用,可能通过扣留或者抑制这些检查点蛋白的活性来突破有丝分裂检查点的屏障。　　总之,我们成功的建立了一个蛋白质相互作用鉴定平台。利用该平台我们系统性的鉴定了FBXO6的相互作用蛋白和糖蛋白.我们发现FBXO6是一个细胞周期特异性磷酸化蛋白,对有丝分裂检查点蛋白的失活起到了重要的调控作用。蛋白质-蛋白质相互作用鉴定平台的建立,为我们今后大规模寻找与疾病相关蛋白质的相互作用蛋白提供了技术支持。