在脊椎动物中,性腺的生殖功能维持需要多种基因的表达,同时这些基因也受到多种转录因子调节。GATA家族转录因子就是其中之一,它们因结构上包含两个保守的锌指结构能识别靶基因启动子序列上的WGATAR基序而得名。同时该家族参与多种组织的发育、分化和基因表达过程。在GATA家族6个成员中Gata4/6在卵巢和精巢中均有表达。已有研究表明,在脊椎动物中Gata4/6在卵巢的滤泡细胞(Follicle cells)和精巢的支持细胞(Sertoli cells)、莱氏细胞(Leydig cells)中表达。并且Gata6也在人和小鼠的生殖细胞中表达。在小鼠卵/精巢中缺失Gata4/6导致性腺发育途径中的相关基因表达大量下调,生殖细胞数量减少,并且阻碍配子生成。同时,Gata4和Gata6在类固醇基因调控上功能相似。在硬骨鱼中,斑马鱼研究了心脏导管中Gata4的功能,同时本实验前期利用real-time PCR和原位杂交等手段对罗非鱼的Gata4/6的表达模式和功能研究进行了初步的探讨。在罗非鱼中,Gata4在成体卵巢的颗粒细胞和鞘膜细胞(Theca cells)以及成体精巢的支持细胞和输精管上皮细胞中表达。本实验室前期研究证实了Gata4对类固醇生成相关因子amh、cyp19a1a、starⅠ/Ⅱ的转录调控作用。Gata6在雌雄成鱼中组织分布情况以及在性腺中的细胞定位。而迄今为止,仍然没有关于Gata6蛋白在硬骨鱼类性腺发育早期的表达研究,也没有Gata4/6这二者在硬骨鱼类生殖过程中的功能研究。尼罗罗非鱼全基因组测序的公开,以及实验室前期研究的八个性腺转录组测序和发表,为进一步研究Gata4/6在尼罗罗非鱼以及硬骨鱼中的表达和功能奠定了基础。在本研究中,利用已测得性腺转录组数据、real-time PCR和免疫组织化学方法研究了Gata6在罗非鱼雌雄性腺不同发育阶段的表达和细胞定位；并利用CRISPR/Cas9系统对尼罗罗非鱼中的Gata4/6进行敲除,进一步研究了它们在类固醇生成和雌雄配子发生过程中的作用。研究结果如下：利用real-time PCR结合性腺转录组数据分析表明,孵化后5天卵巢中gata6 mRNA水平高于精巢,而在其他时期(孵化后10、20、30、50和70天)则是精巢高于卵巢。成功制备了Gata6多克隆抗体,并通过Western-blot的方法对抗体进行检测。利用免疫组化结合已有成鱼性腺中Gata6原位杂交数据分析,Gata6在孵化后5、30天性腺的生殖细胞和体细胞中有表达,在成体精巢的莱氏细胞和成体卵巢的间质细胞和颗粒细胞中表达。此外,在精原细胞和卵原细胞中检测到有少量的Gata6表达。利用CRISPR/Cas9,在雌雄尼罗罗非鱼中成功敲除Gata4和Gata6,最高敲除率分别达到96%和95%。在雌鱼(XX)中,单独敲除Gata4或Gata6,会阻碍颗粒细胞发育和卵黄发生,并且下调卵黄发生前和卵黄发生时的类固醇生成基因cypl9a1a/Cyp19a1a、cyp17a1/Cyp17a1、StARⅡ、foxl2表达以及血清中雌激素17β-estradiol(E2)水平。在雄鱼(XY)中,单独敲除Gata4或Gata6,都会导致精子发生延迟,曲细精管紊乱,莱氏细胞减少以及雄激素生成相关基因cyp11b2/Cyp11b2、cyp17a1/Cyp17a1、cyp11al和StARI/II表达和血清中雄激素11-ketotestosterone(11-KT)水平的下降。同时在Gata4缺失的精巢中还会观察到输精管上皮细胞的空洞化。将单独敲除Gata6的XY阳性GO代雄鱼与正常的雌鱼交配产生F1代,利用酶切和亚克隆测序检测验证其F1会产生Gata6移码和非移码突变,说明Gata6敲除对雄鱼来说是可通过生殖细胞系遗传下去的。综上所述,本研究结果证实了在罗非鱼性腺中的Gata4/6的表达模式与哺乳动物较为一致：主要在类固醇生成细胞中表达。并且二者在硬骨鱼类雌雄性腺类固醇生成和配子发生中具有重要作用。这反映出Gata4/6在脊椎动物中的表达和功能具有保守性。