目的:功能良好的血管通路是保障尿毒症患者长期维持透析的必备条件。动静脉内瘘作为首选的血管通路具有优势。然而,AVF的通畅性又被众多因素影响,导致动静脉内瘘功能障碍。随着内瘘失功机制的不断研究,发现血流动力学的改变及细胞内生物学环境的变化,可能是导致血管内皮细胞功能紊乱、内膜增厚、血管管腔狭窄的主要原因。本研究目的在于探讨剪切力导致内皮细胞功能紊乱的机制,为临床降低动静脉内瘘的失功率提供理论依据。方法:(1)通过平行板的建立,模拟动静脉内瘘时血流动力学的变化,产生不同形式及强度的剪切力,再通过计算流体动力学软件数字模拟技术分析,奠定体外实验的研究基础。(2)在平行板流动腔内置入内皮细胞,采用恒流泵模拟层流剪切力时,模拟低剪切力,强度4dyn/cm~2;生理剪切力,强度12dyn/cm~2;高剪切力,强度20dyn/cm~2;注射泵作用产生周期性的流体运动,模拟震荡剪切力,强度0±4dyn/cm~2。不同剪切力作用0小时、4小时、12小时及24小时。采用免疫荧光技术和实时荧光定量PCR技术检测KLF2、CAV-1、ERK、e NOS的表达及分布情况。给予CAV-1结构破坏剂检测上述细胞因子及蛋白的表达情况。(3)将尿毒症血清加入培养基中,作用于内皮细胞,模拟尿毒症环境下不同剪切力作用时,采用免疫荧光技术及实时q PCR技术,检测KLF2、CAV-1、ERK、e NOS的表达及分布情况。结果:(1)平行板流动腔内的压力为驱动流,在流场内的压强分布沿着z、y方向没有明显变化,压强沿着液体流动方向逐渐减少。在定常流动条件下,分布趋势上的壁面剪切力大体无变化,且剪切力大小与流量大小呈正相关关系。在非定常流动条件下,流量与壁面剪切力随时间的变化发生正弦周期性变化,流量与壁面剪切力有线性关系。(2)生理环境下,在高强度及生理强度层流剪切力作用下,KLF2、Cav-1、e NOS表达增加,ERK表达减低;随着作用时间的延长,KLF2及e NOS的表达逐渐增强,而Cav-1的表达有所下降,ERK表达逐渐减低。在震荡剪切力及低强度层流剪切力作用下,KLF2、Cav-1、e NOS表达减低,ERK表达增强;随着作用时间的延长,KLF2表达逐渐增加,但仍明显低于高强度层流剪切力组,Cav-1、e NOS的表达逐渐减低,而ERK表达逐渐增强。(3)尿毒症环境下,与生理状态相比,KLF2、Cav-1、e NOS表达明显降低,ERK表达增强。给予高强度层流剪切力作用下,KLF2、Cav-1、e NOS表达仍会有改善,但仍不及生理状态下的表达强度;给予震荡剪切力作用下,KLF2、Cav-1、e NOS表达进一步被降低,ERK表达逐渐增强。(4)在震荡剪切力作用下,应用Cav-1结构破坏剂甲基-β-环糊精作用,Cav-1表达减弱,e NOS表达减弱,KLF2、ERK表达增强。结论:平行板流动腔及CFD技术可以用于模拟AVF的血流模式。生理条件下,高强度层流剪切力作用使KLF2、Cav-1、e NOS表达增加,而ERK信号通路相关蛋白表达减低,低强度层流剪切力和震荡剪切力作用使KLF2、Cav-1、e NOS表达减低,ERK信号通路相关蛋白表达增强;在尿毒症环境下,KLF2、Cav-1、e NOS表达明显减弱,高强度层流剪切力作用可改善表达,震荡剪切力会使表达进一步下降;ERK信号通路蛋白表达增加,高强度剪切力降低其表达,而震荡剪切力使ERK信号通路蛋白表达进一步增加。在MβCD作用下,Cav-1、e NOS表达降低,KLF2、ERK表达增强。推测震荡剪切力可能通过直接作用于KLF2,以及Cav-1/e NOS/ERK信号通路导致内皮细胞功能紊乱,进而出现内膜增生,AVF失功。