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本课题共分三大部分，分别讨论以下问题:1.VSELs的体外分离、培养、扩增和优化分选及生物学特性鉴定;2.建立适宜的VSELs细胞向心脏起搏样细胞定向诱导分化体系、探索HCN基因调控心脏起搏样细胞发生的机制及关键信号通路;3.rhG-CSF动员联合麝香保心丸治疗心肌梗死的实验研究。
第一部分 猪骨髓极小胚胎样干细胞的分离、培养及鉴定
目的:
建立猪骨髓极小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells，VSELs)的体外分离、纯化鉴定体系，探索优化分选VSELs的流程，明确VSELs的生物学特性。
方法:
获取猪骨髓后，采用红细胞裂解法从猪骨髓中分离单个核细胞，运用相关特异性抗体CD45，Lin及CXCR4标记，使用免疫磁珠分选器及流式细胞仪分选获得VSELs，将乳猪成肌细胞作为饲养层培养，使用光学显微镜及透射电镜观察猪骨髓VSELs的形态特征、增殖情况和超微结构，并采用免疫荧光染色和碱性磷酸酶染色的方法鉴定干细胞标志的表达。
结果:
采用免疫磁珠分选器及流式细胞仪分选的方法，可从猪骨髓中分离到贴壁生长的细胞，与骨髓间充质干细胞相比，这些细胞体积小、形态均一，不易扩增，且表达多潜能抗原标志SSEA-1、Oct-4、Nanog和Sox-2，同时碱性磷酸酶染色阳性。VSELs呈核大胞浆少特点，胞核中可见部分细胞器结构，呈现明显幼稚细胞特点。定量PCR及凝胶电泳结果显示VSELs细胞高表达CD133、SOX-2、OCT-4、NANOG等干细胞特异性基因。
结论:
采用免疫磁珠分选器及流式细胞仪分选技术可以从猪骨髓中分离到表达多潜能干细胞标志的VSELs。
第二部分 基于HCN转染VSELs构建生物起搏信号通路筛选诱导剂研究
目的:
建立适宜的VSELs细胞向心脏起搏样细胞定向诱导分化体系、探索HCN基因调控心脏起搏样细胞发生的机制及关键信号通路。
方法:
①参照MSCs的诱导分化体系，将纯化的P2代VSELs细胞接种于铺有基质胶的24孔板中用成神经细胞诱导培养液（1640+体积分数为10％胎牛血清+RA/IBMX）、成脂细胞诱导培养液（体积分数为10％胎牛血清的1640培养基+0.5μmol/L地塞米松+10mg/L胰岛素+0.5mmol/LIBMX+50mol/L吲哚美辛）、心肌细胞诱导液（10μmol/L5-Aza+无血清基础培养基）替换各诱导孔的VSELs细胞培养液。每隔24h仔细观察添加诱导剂后细胞的形态变化;②用胰酶将处于对数生长期的P2代VSELs细胞制成细胞悬液，在裸鼠的右侧腋窝皮下、腹腔各注射200μl细胞悬液，注射细胞后每日观察裸鼠的生长、饮食、精神活动等状况;③HCN基因慢病毒质粒载体转染及转染后诱导分化，构建MSCs、VSELs诱导分化过程关键基因的信号通路。慢病毒载体构建成功后，提取质粒备用，将传代后的MSCs、VSEL接种于24孔板，细胞增殖至每孔面积70％时，按照Fugen转染体系分别转染HCN1、2、4基因，转染后添加基础培养基正常培养，分别于转染后12h、24h、48h观察绿色荧光，计数转染效率;④全细胞膜片钳记录稳定转染HCN阳性VSELs起搏离子通道电流:将转染阳性的MSCs、VSELs细胞用0.25％胰酶消化后，加入细胞外液。在光镜和荧光显微镜下选择带有绿色荧光的单个干细胞进行实验，用微操纵器将玻璃微电极缓慢靠近细胞，将玻璃微电极轻轻压于细胞中央后轻轻给予玻璃微电极负压吸引，等待电极尖端与细胞膜表面形成1GΩ以上的高阻封接，补偿电极电容，给玻璃微电极内轻施脉冲式负压进行破膜，使细胞与电极内液直接相通而与细胞外液绝缘，补偿细胞膜电容及串联电阻，由此构建全细胞记录模式记录离子流。
结果:
①通过对VSELs体外分化能力鉴定发现，VSELs诱导神经元样细胞甲苯胺蓝染色鉴定阳性;VSELs诱导脂肪样细胞油红染色阳性;VSELs诱导心肌样细胞免疫荧光结果显示心肌样细胞特异性蛋白阳性，由此证实了VSELs具有多向分化潜能;②VSELs裸鼠成瘤实验发现注射VSELs的裸鼠的生长、饮食、精神活动等状况均良好，皮下注射位置未见明显肿瘤包块形成，腹腔未触及肿块形成。连续观察1月后处死裸鼠，剥离皮肤及腹腔内组织，在注射位置均未分离得到肿瘤组织;③HCN基因慢病毒质粒载体可成功转入MSCs、VSEL细胞中，且48h时荧光信号最强;④HCN转染后MSC及VSELs细胞均可检测到典型电流信号，不同亚型HCN基因转染后膜电流强度不同，相同HCN基因转染MSC及VSELs所得电流强度也存在差别。
结论:
我们将所培养的VSELs诱导分化为神经元样细胞、心肌样细胞和脂肪样细胞确立了其具有三胚层细胞分化的特性，不具有恶性增殖成瘤性能。将HCN基因慢病毒质粒载体转染至VSELs，建立了VSELs诱导分化为心脏起搏样细胞定向诱导分化体系，探索了HCN基因调控心脏起搏样细胞发生的机制及关键信号通路。
第三部分 rhG-CSF动员联合麝香保心丸治疗心肌梗死的实验研究
目的:
研究麝香保心丸联合重组人粒细胞集落刺激因子(recombinat human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)动员基础上对急性心肌梗死兔的治疗作用。
方法:
以普通健康大耳兔为研究对象，全麻下开胸结扎冠状动脉左前降支近段建立心肌梗死模型。动物模型分为对照组（Ⅰ组）、rhG-CSF动员组（Ⅱ组）、麝香保心丸喂养组（Ⅲ组）、rhG-CSF动员与麝香保心丸联合喂养组（Ⅳ组）。观察各组动物治疗前后一般情况，测定各组动物治疗前后心功能并于6周后取心脏组织作相关病理检查。
结果:
与Ⅰ组相比，其余三组动物治疗后一般情况均改善，左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)明显增加(P＜0.05)，左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd)明显缩小，室壁运动显著增强;心肌梗死面积明显缩小(P＜0.05)，梗死区毛细血管数目显著增多(P＜0.05)。Ⅳ组与Ⅱ组相比，LVEF进一步增加(P＜0.05)，LVEDd缩小无明显差异(P＞0.05)，左室后壁运动增强。毛细血管数目显著增多(P＜0.05)，心肌梗死面积变化无统计学差异(P＞0.05)。
结论:
麝香保心丸、rhG-CSF动员以及在此基础上加用麝香保心丸喂养均可改善急性心肌梗死兔的一般情况，改善心功能，缩小心肌梗死面积，促进血管增生，而rhG-CSF动员联合麝香保心丸干预后心功能改善及血管增生更为明显。
第一部分 猪骨髓极小胚胎样干细胞的分离、培养及鉴定
目的:
建立猪骨髓极小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells，VSELs)的体外分离、纯化鉴定体系，探索优化分选VSELs的流程，明确VSELs的生物学特性。
方法:
获取猪骨髓后，采用红细胞裂解法从猪骨髓中分离单个核细胞，运用相关特异性抗体CD45，Lin及CXCR4标记，使用免疫磁珠分选器及流式细胞仪分选获得VSELs，将乳猪成肌细胞作为饲养层培养，使用光学显微镜及透射电镜观察猪骨髓VSELs的形态特征、增殖情况和超微结构，并采用免疫荧光染色和碱性磷酸酶染色的方法鉴定干细胞标志的表达。
结果:
采用免疫磁珠分选器及流式细胞仪分选的方法，可从猪骨髓中分离到贴壁生长的细胞，与骨髓间充质干细胞相比，这些细胞体积小、形态均一，不易扩增，且表达多潜能抗原标志SSEA-1、Oct-4、Nanog和Sox-2，同时碱性磷酸酶染色阳性。VSELs呈核大胞浆少特点，胞核中可见部分细胞器结构，呈现明显幼稚细胞特点。定量PCR及凝胶电泳结果显示VSELs细胞高表达CD133、SOX-2、OCT-4、NANOG等干细胞特异性基因。
结论:
采用免疫磁珠分选器及流式细胞仪分选技术可以从猪骨髓中分离到表达多潜能干细胞标志的VSELs。
第二部分 基于HCN转染VSELs构建生物起搏信号通路筛选诱导剂研究
目的:
建立适宜的VSELs细胞向心脏起搏样细胞定向诱导分化体系、探索HCN基因调控心脏起搏样细胞发生的机制及关键信号通路。
方法:
①参照MSCs的诱导分化体系，将纯化的P2代VSELs细胞接种于铺有基质胶的24孔板中用成神经细胞诱导培养液（1640+体积分数为10％胎牛血清+RA/IBMX）、成脂细胞诱导培养液（体积分数为10％胎牛血清的1640培养基+0.5μmol/L地塞米松+10mg/L胰岛素+0.5mmol/LIBMX+50mol/L吲哚美辛）、心肌细胞诱导液（10μmol/L5-Aza+无血清基础培养基）替换各诱导孔的VSELs细胞培养液。每隔24h仔细观察添加诱导剂后细胞的形态变化;②用胰酶将处于对数生长期的P2代VSELs细胞制成细胞悬液，在裸鼠的右侧腋窝皮下、腹腔各注射200μl细胞悬液，注射细胞后每日观察裸鼠的生长、饮食、精神活动等状况;③HCN基因慢病毒质粒载体转染及转染后诱导分化，构建MSCs、VSELs诱导分化过程关键基因的信号通路。慢病毒载体构建成功后，提取质粒备用，将传代后的MSCs、VSEL接种于24孔板，细胞增殖至每孔面积70％时，按照Fugen转染体系分别转染HCN1、2、4基因，转染后添加基础培养基正常培养，分别于转染后12h、24h、48h观察绿色荧光，计数转染效率;④全细胞膜片钳记录稳定转染HCN阳性VSELs起搏离子通道电流:将转染阳性的MSCs、VSELs细胞用0.25％胰酶消化后，加入细胞外液。在光镜和荧光显微镜下选择带有绿色荧光的单个干细胞进行实验，用微操纵器将玻璃微电极缓慢靠近细胞，将玻璃微电极轻轻压于细胞中央后轻轻给予玻璃微电极负压吸引，等待电极尖端与细胞膜表面形成1GΩ以上的高阻封接，补偿电极电容，给玻璃微电极内轻施脉冲式负压进行破膜，使细胞与电极内液直接相通而与细胞外液绝缘，补偿细胞膜电容及串联电阻，由此构建全细胞记录模式记录离子流。
结果:
①通过对VSELs体外分化能力鉴定发现，VSELs诱导神经元样细胞甲苯胺蓝染色鉴定阳性;VSELs诱导脂肪样细胞油红染色阳性;VSELs诱导心肌样细胞免疫荧光结果显示心肌样细胞特异性蛋白阳性，由此证实了VSELs具有多向分化潜能;②VSELs裸鼠成瘤实验发现注射VSELs的裸鼠的生长、饮食、精神活动等状况均良好，皮下注射位置未见明显肿瘤包块形成，腹腔未触及肿块形成。连续观察1月后处死裸鼠，剥离皮肤及腹腔内组织，在注射位置均未分离得到肿瘤组织;③HCN基因慢病毒质粒载体可成功转入MSCs、VSEL细胞中，且48h时荧光信号最强;④HCN转染后MSC及VSELs细胞均可检测到典型电流信号，不同亚型HCN基因转染后膜电流强度不同，相同HCN基因转染MSC及VSELs所得电流强度也存在差别。
结论:
我们将所培养的VSELs诱导分化为神经元样细胞、心肌样细胞和脂肪样细胞确立了其具有三胚层细胞分化的特性，不具有恶性增殖成瘤性能。将HCN基因慢病毒质粒载体转染至VSELs，建立了VSELs诱导分化为心脏起搏样细胞定向诱导分化体系，探索了HCN基因调控心脏起搏样细胞发生的机制及关键信号通路。
第三部分 rhG-CSF动员联合麝香保心丸治疗心肌梗死的实验研究
目的:
研究麝香保心丸联合重组人粒细胞集落刺激因子(recombinat human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)动员基础上对急性心肌梗死兔的治疗作用。
方法:
以普通健康大耳兔为研究对象，全麻下开胸结扎冠状动脉左前降支近段建立心肌梗死模型。动物模型分为对照组（Ⅰ组）、rhG-CSF动员组（Ⅱ组）、麝香保心丸喂养组（Ⅲ组）、rhG-CSF动员与麝香保心丸联合喂养组（Ⅳ组）。观察各组动物治疗前后一般情况，测定各组动物治疗前后心功能并于6周后取心脏组织作相关病理检查。
结果:
与Ⅰ组相比，其余三组动物治疗后一般情况均改善，左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)明显增加(P＜0.05)，左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd)明显缩小，室壁运动显著增强;心肌梗死面积明显缩小(P＜0.05)，梗死区毛细血管数目显著增多(P＜0.05)。Ⅳ组与Ⅱ组相比，LVEF进一步增加(P＜0.05)，LVEDd缩小无明显差异(P＞0.05)，左室后壁运动增强。毛细血管数目显著增多(P＜0.05)，心肌梗死面积变化无统计学差异(P＞0.05)。
结论:
麝香保心丸、rhG-CSF动员以及在此基础上加用麝香保心丸喂养均可改善急性心肌梗死兔的一般情况，改善心功能，缩小心肌梗死面积，促进血管增生，而rhG-CSF动员联合麝香保心丸干预后心功能改善及血管增生更为明显。