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【研究目的】肝再生是一个相对保守但又复杂的进化过程,通过细胞内、各种细胞间的相互作用,促进肝细胞的增殖、肝脏结构的重建、肝功能的恢复。然而,肝细胞是如何启动内皮细胞的增殖促进肝再生是未知的。利用70%肝切除术(PHx)急性肝损伤模型和CCl4诱导的慢性肝损伤模型模拟肝再生,探索Gankyrin在肝再生过程中的作用及机制,为临床各种原因引起的肝损伤的治疗提供一定的理论依据。【研究方法】1.2/3肝切除(PHx)模型的建立:手术切除小鼠肝脏左外叶及中叶,我们选取各个时间点,分别检测小鼠肝体比、肝体比恢复速率,制作了恢复曲线;并收集血液、肝脏等标本。2.药物性肝损伤模型:给予6周小鼠注射5%CCL45ul/g一周三次。我们选取了3个时间点收取样本。3.原代细胞的分离及培养:利用肝脏灌注法获得原代细胞,梯度离心获得的肝实质细胞用原培培养,非实质细胞用于流式分选。4.细胞流式分析:流式双标检测VEGFR2和CD34,检测2/3肝切除术后不同时间点LSEC数目。5.细胞共培养:5.1两种细胞混合培养:SVEC4-10感染lentivirus-delivered RFP和原代肝细胞感染adenovirus-delivered GFP按照1:2共培养,计算内皮细胞数目。5.2 transwell inserts共培养:SVEC4-10置于transwell inserts上层,原代肝细胞置于transwell inserts下层按照1:2接种,培养。检测内皮细胞增殖数目。6.资料收集及统计方法:6.1.我们随机选取了2010年9月至2014年10在我院行肝癌切除术的87例远离癌巢的的患有不同程度肝硬化的病人肝脏标本,制作组织芯片,组织匀浆ELLISA检测,提取组织蛋白做Western blot。免疫组化检测VEGFA、CD31、HIF-1a;ELLISA检测VEGFA;Western blot检测Gankyrin、HNF-4a、VE-cadherin、a-SMA。6.2.统计软件为SPSS 21,结果表示为mean±SEM。运用t检验检测肝体比,肝体比恢复速率,免疫组化、免疫荧光、CCK8细胞计数,流式分析等。运用线性相关性线性回归检测两样本相关性。P<0.05表示显著差异,为*,P<0.01为**,P<0.001为***。【研究结果】1.在2/3肝切除肝再生中Gankyrin表达上调以及Gankyrin条件性敲出小鼠的建立、繁殖和敲除小鼠的表型鉴定。2.在2/3肝切除模型中Gankyrin敲除后肝再生速度减缓。3.在肝再生过程中肝细胞来源的Gankyrin调节LSEC增殖。4.Gankyrin敲除小鼠的肝细胞释放VEGFA减少,延缓了肝再生后期LSEC的增殖。5.Gankyrin通过HIF-1a表达促进了VEGFA的释放。6.在CCL4诱导的慢性肝损伤肝再生模型中,肝细胞来源的Gankyrin促进内皮细胞增殖。7.在临床肝硬化的样本中发现肝细胞内的Gankyrin和内皮细胞存在一定相关性,可能通过促进HIF-1a和VEGFA的表达,促进了内皮细胞增殖。【结论】在研究中我们发现无论是2/3肝切除肝再生还是CCL4诱导的慢性肝再生过程中肝细胞来源的Gankyrin通过HIF-1a促进VEGFA的外分泌增加,促进了肝血窦内皮细胞增殖,促进了肝再生。临床肝硬化样本中Gankyrin表达的上调与肝血窦内皮细胞增殖具有紧密相关性。