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肝X受体(Liver X receptors,LXRs)是一种孤核受体,存在LXR-α和LXR-β,在国际名称标准中,LXR-α 被称作 Nuclear receptor subfamily 1 group H member 3(NR1H3),LXR-β 被称作 Nuclear receptor subfamily 1 group H member2(NR1H2)两种亚型。NR1H3和NR1H2在许多组织和细胞中表达,如肝、肠、脂肪细胞和巨噬细胞。稍有不同的是,NR1H3在乳腺、食道、胰腺以及肝脏内呈现较高水平表达,NR1H2则在各种组织和细胞中普遍表达。最近的研究表明,LXRs对肿瘤的发生发展有一定的抑制作用,LXRs的激动剂也在多种癌症细胞中发挥抑制肿瘤增殖的作用,如乳腺癌、肝癌、宫颈癌、肺癌和皮肤癌细胞等。研究表明,代谢综合征与多种癌症(包括结肠癌、胰腺癌、乳腺癌以及子宫内膜癌)密切相关。子宫内膜癌是目前女性最普遍患有的妇科恶性疾病之一,研究发现代谢综合征对子宫内膜癌的产生有十分重要的影响。由于NR1H3和NR1H2在代谢综合征中起到重要的调节作用,因此我们假设NR1H3和NR1H2也可能在子宫内膜癌中扮演了有意义的角色。尽管目前已经有研究探索了 NR1H3和NR1H2在肿瘤中的作用和机制。然而,关于NR1H3和NR1H2在子宫内膜癌中的作用和机制研究仍然非常有限。在本研究中,我们旨在揭示子宫内膜腺癌组织与正常内膜组织之间NR1H3和NR1H2表达的差异,发现亚型NR1H3在子宫内膜腺癌中的表达水平异常。此外我们还研究了 NR1H3对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和周期的影响以及可能涉及的分子机制。第一部分:NR1H3在子宫内膜腺癌组织中的表达和有关临床病理指标、临床预后的初步分析1.NR1H3在子宫内膜腺癌组织中的表达水平目的:对比NR1H3和NR1H2在子宫内膜癌以及正常子宫内膜的组织内的表达情况。方法:收集90例子宫内膜病理组织,其中选取30例正常子宫内膜组织,20例子宫内膜息肉组织以及40例不同分期的子宫内膜腺癌的组织。采用免疫组化法测定其NR1H3和NR1H2的表达水平。并进一步用免疫组化法测定子宫内膜癌组织芯片中NR1H3的表达水平。结果:1.NR1H2蛋白在正常子宫内膜组织、内膜息肉以及子宫内膜腺癌组织内的表达水平无显著差异(P>0.05)。和其他组相比,NR1H3蛋白在子宫内膜腺癌组织的表达水平较高(P<0.01)。2.组织芯片检测结果显示,NR1H3蛋白在子宫内膜腺癌组织中的阳性表达率显著高于正常子宫内膜组织(P<0.05)。3.NR1H3蛋白在子宫内膜癌组织中阳性表达,且主要定位在细胞浆。结论:NR1H3蛋白在子宫内膜腺癌的组织切片中呈现较高水平的表达。2.NR1H3表达差异与子宫内膜腺癌临床病理学参数关系的初步分析目的:通过分析收集的子宫内膜腺癌患者的详细临床病理学参数,主要为年龄、临床分期、分化状态、肌层浸润程度和淋巴结的转移情况,进一步研究NR1H3对于子宫内膜癌的产生过程中可能起到的作用,并评估其与预后的关系。方法:用χ2检验NR1H3蛋白表达差异与不同子宫内膜腺癌临床病理特征间的关系,使用GraphPad Prism6.0软件制作生存曲线图,利用Breslow生存分析比较不同表达类型与预后关系。结果:1.40例子宫内膜腺癌患者,NR1H3蛋白阳性表达组及阴性表达组在年龄、手术分期、肌层浸润程度和淋巴结的转移情况中二者相比,不具有显著差异(P>0.05)。但是在组织分化程度上,G1级与G3级相比及G2级与G3级相比,具有显著差异(P<0.05)。2.NR1H3蛋白阳性表达组与阴性表达组相比,患者的生存率明显上升,具有显著差异(P<0.05)。结论:NR1H3蛋白阳性表达也许预示着患有子宫内膜腺癌的病人可能具有较高的癌症分化程度及较好的预后。NR1H3蛋白可能起到抑制肿瘤进展的作用。第二部分 NR1H3对子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞生物学行为产生的影响及其分子调控机制的初步研究1.NR1H3对子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞生物学行为产生的影响目的:研究NR1H3激动剂T0901317处理对子宫内膜癌Ishikawa细胞株增殖和周期产生的影响,探讨NR1H3对子宫内膜癌的生物学机理。方法:采用细胞免疫荧光实验检测NR1H3蛋白在Ishikawa细胞中的表达。采用不同浓度梯度T0901317试剂处理Ishikawa细胞和不同时间梯度处理Ishikawa细胞。利用MTT实验方法研究T0901317试剂对Ishikawa细胞增殖的影响;利用流式细胞仪研究T0901317试剂对Ishikawa细胞周期的影响。结果:1.NR1H3蛋白在子宫内膜癌Ishikawa细胞中阳性表达,且主要定位在细胞浆中。2.T0901317处理细胞48小时,随着T0901317浓度增加,细胞增殖抑制率增加(P<0.05);10μM浓度的T0901317处理细胞中,抑制率随处理时间的延长而增加(P<0.05)。3.通过流式细胞仪分析细胞周期,发现T0901317处理的细胞中增殖指数为0.37±0.02,明显低于用DMSO处理组(增殖指数为0.6±0.03)(P<0.01)。结论:NR1H3蛋白在子宫内膜癌Ishikawa细胞系中呈现高水平表达状态,NR1H3的激动剂T0901317能够有效抑制子宫内膜癌细胞的增殖和G1/S转变。2.NR1H3对Ishikawa细胞生物学影响分子调控机制的初步研究目的:探索NR1H3激动剂T0901317处理子宫内膜癌Ishikawa细胞中发挥功能的可能涉及到的分子机制,可以进一步为子宫内膜癌针对性LXRs临床治疗奠定一定的基础。方法:利用不同浓度梯度NR1H3激动剂T0901317试剂处理Ishikawa细胞和不同时间梯度处理Ishikawa细胞。利川PCR和免疫印迹的手段,分析T0901317试剂对Ishikawa细胞中NR1H3、CCND1和CCNE基因mRNA和蛋白表达水平的影响。结果:1.NR1H3基因的mRNA和蛋白表达水平随着NR1H3激动剂T0901317浓度增加而增加(P<0.05),并且随着T0901317作用时间的延长而增加(P<0.05)。2.CCND1基因的mRNA和蛋白表达水平随着T0901317浓度增加而降低(P<0.05),并且随着T0901317作用时间的延长而降低(P<0.05)。3.CCNE基因的mRNA和蛋白表达水平随着T0901317浓度增加而降低(P<0.05),并且随着T0901317作用时间的延长而降低(P<0.05)。结论:NR1H3激动剂T0901317能够有效促进子宫内膜癌细胞中NR1H3基因的表达,并抑制CCND1和CCNE基因的表达。NR1H3激动剂T0901317可能通过细胞周期分子通路对子宫内膜癌细胞增殖产生抑制作用。