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目的:1、观察Ihh(印度刺猬蛋白)基因敲除后小鼠生长板大体结构及其内软骨细胞形态分布的改变;2、观察Ihh基因敲除后小鼠骨骺内(本应形成生长板的区域)矿化现象改变的具体过程及特点;3、初步观察Ihh基因敲除后小鼠生长板内Ihh下游相关因子PTHr P及BMP-6的表达变化趋势。方法:用基因型为Ihhfl/fl和Col2a1-Cre ERT2;Ihhfl/fl的基因工程小鼠繁殖,并用RT-PCR技术鉴定新生小鼠基因型。将鉴定出的刚出生的基因型为Col2a1-Cre ERT2;Ihhfl/fl小鼠随机分为实验组及对照组。于小鼠出生后第一天及第二天,实验组小鼠腹腔注射雌激素受体拮抗剂TM(托马西酚)溶液诱导敲除Ihh基因,对照组小鼠腹腔注射同等量植物油。完成Ihh基因敲除后:(1)取小鼠出生后第14天,观察两组小鼠大体照,并行下肢X线观察小鼠下肢胫骨。(2)分别在小鼠出生后第6、8、10、12、14天五个时间点通过番红O染色观察实验组和对照组骨骺内各种类型软骨细胞形态和分布的特点及变化,(3)及通过Vonkasso(矿化)染色观察骨骺矿化过程的变化。(4)用出生后第6天小鼠通过免疫组织化学染色初步观察Ihh下游相关因子甲状旁腺激素相关肽(PTHr P)及骨形态发生蛋白6(BMP-6)的表达变化趋势。结果:第六天实验组小鼠番红O染色显示胫骨近端骨骺无明显的按软骨细胞成熟程度形成的结构分区,但有大量异常出现的大而圆的肥大软骨细胞充填在骨骺内,而几乎观察不到扁平的呈柱状排列的增殖形态软骨细胞;对照组小鼠则显示骨骺结构发育良好且按软骨细胞分化程度依次形成:静止软骨细胞区、增殖软骨细胞区及肥大软骨细胞区。第八天实验组小鼠番红O染色可见骨骺内软骨细胞进一步成熟肥大,并通过Vonkasso染色可见骨骺内有数个矿化点出现;而对照组小鼠骨骺内则无矿化现象出现。第10天实验组小鼠Vonkasso染色可见骨骺内出现大量矿化点;而在对照组小鼠骨骺内仍未发现矿化,但开始形成二次骨化中心。第12天实验组小鼠骨骺矿化现象延伸到骨骺大部分区域;而对照组小鼠骨骺二次骨化中心初步形成。第14天实验组小鼠矿化现象占据骨骺除未来形成关节软骨的所有区域,且矿化密度增加,最终并无生长板结构形成;而对照组小鼠二次骨化中心及生长板发育已完善。第6天实验组小鼠骨骺PTHr P(聚集于增殖区软骨细胞周围)免疫组化染色较对照组小鼠明显变浅,而BMP-6(表达于肥大区软骨细胞内)则较对照组小鼠染色加深。第14天Ihh基因敲除组小鼠身长及四肢短缩畸形最为明显,并于X线下观察下肢时发现:对照组小鼠胫骨近端骨骺可见经典生长板结构(即骺线)及二次骨化中心结构,Ihh基因敲除组小鼠生长板结构完全消失。结论:Ihh基因与小鼠生长板内软骨细胞按分化程度有序分区的现象密切相关。将小鼠Ihh基因敲除后,本应未来形成生长板结构区域的软骨细胞过早肥大成熟、基质矿化,导致正常生长板结构难以形成,并可能会引起抑制软骨细胞成熟的PTHr P及促进软骨细胞成熟的BMP-6表达变化。