论文部分内容阅读
目的和意义鼻咽癌转移是影响鼻咽癌患者预后及生存率的主要因素。文献报道,临床上确诊鼻咽癌病例中有60%以上已有颈淋巴结转移或远处转移,约有1/3患者初诊时即以转移症状就诊;一旦发现转移病灶,患者中位生存期不超过1年。因此,研究鼻咽癌转移的分子机制,寻找治疗靶点,对提高鼻咽癌治疗疗效,延长病人生命有重要的临床指导意义。趋化因子受体-4（chemine receptor-4,CXCR4）是目前研究较深入的趋化因子受体,主要由炎性细胞和肿瘤细胞分泌,文献报道CXCR4在多种恶性肿瘤的发生发展和转移中起重要作用,但其在鼻咽癌中的作用目前鲜有研究。本实验拟研究CXCR4在不同转移潜能的鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞株的表达情况,探讨CXCR4在鼻咽癌转移中的作用及其与鼻咽癌临床分期、淋巴结转移状态、分化程度的相关性;研究鼻咽癌组织中CXCR4和LMP-1作用通路的相关性;探讨SDF-1α/CXCR4在鼻咽癌细胞趋向远处靶器官转移中的作用。方法1.临床标本收集及实验分组收集2006年10月至2007年4月确诊的鼻咽癌组织和健康志愿者的鼻咽组织,共45例,包括30例鼻咽癌组织（其中无颈淋巴结转移者14例,伴颈淋巴结转移者16例）和15例正常鼻咽组织（对照组）。鼻咽癌易转移的远处靶器官组织（颈部淋巴结、肺、骨髓、肝脏,各5例）和不易转移的远处靶器官组织（肾脏、结肠,各5例）,其中颈淋巴结标本来自鼻咽癌患者,其它标本取自因相应器官肿瘤而手术切除的距肿瘤安全切缘3cm以外的器官组织。所有标本均行HE染色证实无癌细胞浸润。2.鼻咽癌细胞株的培养EB病毒阳性的人类低分化鼻咽癌细胞株C666-1,有转移能力的鼻咽癌细胞株5-8F和无转移能力的鼻咽癌细胞株6-10B,高分化鼻咽癌细胞株CNE-1和Hone-1,低分化鼻咽癌细胞株CNE-2,EB病毒转化的绒猴B淋巴细胞B95-8为本科室保存。所有细胞均培养于37℃、100%湿度、5%CO2环境中,用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化传代,以含15%FBS的RP1640培养液（含100ug青霉素/ml+100ug链霉素/ml）隔天换液。3.RT-PCR按常规法提取组织及细胞株的总RNA,逆转录成CDNA后根据引物序列PCR扩增。所有PCR产物在加入溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中电泳,紫外线下照相后采用凝胶图像分析软件（Bandscan5.0）作条带密度扫描,结果以CXCR4/GAPDH和LMP-1/GAPDH的灰度对数比值分别表示CXCR4mRNA和LMP-1 mRNA的相对表达强度。4.IHC检测待检组织的石蜡切片按SP免疫组化三步法进行染色,光镜下观察显色结果。采用Bresalier半定量公式稍加修改判断染色结果:切片在10倍物镜视野下观察,随机计数5个视野中各细胞的染色强度,根据细胞染色强度分为四级,并分别计分:阴性,细胞无着色（0分）;弱阳性,细胞着色为浅黄色（1分）;中度阳性,细胞着色为棕黄色（2分）;强阳性,细胞着色为棕褐色（3分）,计算每一强度的视野数,根据下列公式计算每张切片的平均染色强度=∑{（0×F0）+（1×F1）+（2×F2）+（3×F3）},Fi=%10×视野数（i=0,1,2,3）。5.统计学分析所有计量资料结果用（?）±S表示,不同组别LMP-1mRNA和CXCR4mRNA表达水平的比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA）,多重比较采用LSD法;同一患者鼻咽癌原发灶和颈淋巴结转移灶中LMP-1蛋白表达的比较、CXCR4蛋白表达的比较采用两相关样本的非参数检验（Wilcoxon法）,其余免疫组化结果的比较均采用Kruskal-Wallis检验。mRNA表达水平之间的相关性分析采用Pearson线性相关,蛋白表达水平之间的相关性分析采用Sperman等级相关。P<0.05为差异有统计学意义。所有数据采用SPSS11.5统计软件包进行统计学处理。结果1.CXCR4和LMP-1在正常鼻咽组织及鼻咽癌组织的表达RT-PCR检测结果显示正常鼻咽组织、无颈淋巴结转移鼻咽癌组织、伴颈淋巴结转移鼻咽癌组织CXCR4mRNA表达水平分别为0.185±0.126,0.631±0.287,0.856±0.299,使用单因素方差分析（One-way ANOVA）、LSD多重比较方法的统计分析结果显示差异有显著性意义（F=28.449,P=0.000）,伴颈淋巴结转移者最高,正常鼻咽组织最低;IHC检测结果显示正常鼻咽组织、无颈淋巴结转移鼻咽癌组织、伴颈淋巴结转移鼻咽癌组织CXCR4蛋白表达强度（以平均秩次表示）分别为9.47,21.79,36.75,Kruskal-Wallis检验结果示差异有显著性意义（X2=34.521,P=0.000）,伴颈淋巴结转移者最高,正常鼻咽组织最低。CXCR4mRNA和蛋白表达水平同鼻咽癌患者的临床分期、淋巴结转移显著正相关,同细胞的分化程度显著负相关（P均<0.01）。15例先后行鼻咽部和颈部淋巴结活检并明确诊断为癌和癌转移的患者,颈部淋巴结转移癌中CXCR4蛋白表达强度高于相应鼻咽癌原发灶,两相关样本的非参数检验（Wilcoxon法）结果示差异有显著性意义（Z=-2.724,P=0.006）。RT-PCR检测结果显示正常鼻咽组织、无颈淋巴结转移鼻咽癌组织、伴颈淋巴结转移鼻咽癌组织LMP-1mRNA表达水平分别为0.541±0.284,0.637±0.288,0.966±0.198,使用单因素方差分析（One-way ANOVA）统计结果示差异有显著性意义（F=11.551,P=0.000）,LSD多重比较统计结果示除正常鼻咽组织与无颈部淋巴结转移的鼻咽癌组织之间无显著性差异外（P＞0.05）,其余各组之间差异均有显著性意义（P均＜0.01）,以伴颈淋巴结转移者最高,正常鼻咽组织最低。IHC检测结果显示正常鼻咽组织、无颈淋巴结转移鼻咽癌组织、伴颈淋巴结转移鼻咽癌组织LMP-1蛋白表达强度（以平均秩次表示）分别为11.83,19.46,36.56,Kruskal-Wallis检验结果示差异有显著性意义（X2=30.082,P=0.000）,伴颈淋巴结转移者最高,正常鼻咽组织最低。LMP-1mRNA和蛋白表达同鼻咽癌患者的临床分期、淋巴结转移显著正相关（P均＜0.01）,同细胞的分化程度无显著相关性（P＞0.05）。15例先后行鼻咽部和颈部淋巴结活检并明确诊断为癌和癌转移的患者,颈部淋巴结转移癌中LMP-1蛋白表达强度高于相应鼻咽癌原发灶,两相关样本的非参数检验（Wilcoxon法）结果示差异有显著性意义（Z=-2.233,P=0.026）。2.CXCR4和LMP-1在鼻咽癌细胞株的表达RT-PCR结果示鼻咽癌细胞株C666-1、5-8F、6-10B、CNE-1、CNE-2中CXCR4mRNA的表达水平分别为0.974±0.015、0.836±0.023、0.648±0.013、0.642±0.026、0.628±0.019,Hone-1无CXCR4mRNA的表达;单因素方差分析（One-way ANOVA）及LSD多重比较结果示6-10B和CNE-1之间无显著性差异（P=0.642）,6-10B和CNE-2之间无显著性差异（P=0.131）,CNE-1和CNE-2之间无显著性差异（P=0.284）,其余各组之间CXCR4mRNA表达水平均有显著性差异（P=0.000）。其中C666-1中CXCR4mRNA表达水平最高,CNE-2最低;巢式PCR结果示仅C666-1有LMP-1mRNA的表达（1.014±0.042）,5-8F、6-10B、CNE-1、CNE-2、Hone-1均无LMP-1mRNA的表达,C666-1中CXCR4mRNA和LMP-1mRNA的表达水平存在显著相关性。3、鼻咽癌中CXCR4和LMP-1表达的相关性Pearson线性相关分析结果示鼻咽癌组织中CXCR4mRNA（0.751±0.310）和LMP-1mRNA（0.813±0.292）的表达水平存在显著相关性（r=0.491,P=0.006）;正常鼻咽组织CXCR4mRNA（0.185±0.126）和LMP-1mRNA（0.541±0.284）的表达水平无显著相关性（r=0.067,P=0.812）。Sperman等级相关分析结果示鼻咽癌组织中CXCR4蛋白（1.176±0.911）和LMP-1蛋白（0.687±0.645）的表达水平存在显著相关性（r=0.724,P=0.000）,但正常鼻咽组织CXCR4蛋白（0.303±0.195）和LMP-1蛋白（0.170±0.186）的表达水平无显著相关性（r=0.001,P=0.997）。rAAV-shRNA-LMP-1转染至C666-1细胞抑制LMP-1的表达后,C666-1中CXCR4mRNA的表达显著下调但仍有低水平表达。4、SDF-1α蛋白在鼻咽癌远处靶器官的表达Kruskal-Wallis检验统计分析结果示鼻咽癌易转移的正常颈部淋巴结、肺、骨髓、肝脏中SDF-1α蛋白表达强度（以平均秩次表示）分别为20.80,22.40,20.60,17.20,而不易转移的肾脏和结肠中SDF-1α蛋白表达强度分别为6.40,5.60,两组之间差异有显著性意义（X2=19.759,P=0.001）,鼻咽癌易转移的远处靶器官SDF-1α蛋白表达水平较高。结论1.正常鼻咽组织、无颈淋巴结转移鼻咽癌组织、伴颈淋巴结转移鼻咽癌组织存在CXCR4mRNA和蛋白表达,其表达水平依次显著升高。2.鼻咽癌颈淋巴结转移灶中CXCR4蛋白的表达水平显著高于相应的原发灶。3.CXCR4mRNA和蛋白的表达水平与鼻咽癌的临床分期和淋巴结转移状态呈正相关,与癌细胞的分化程度呈负相关。4.鼻咽癌组织中CXCR4和LMP-1mRNA和蛋白的表达均显著相关。5.鼻咽癌细胞株C666-1、5-8F、6-10B、CNE-1、CNE-2均不同程度表达CXCR4mRNA,其中C666-1表达水平最高,CNE-2最低;但上述细胞株中仅C666-1表达LMP-1mRNA,C666-1中CXCR4mRNA和LMP-1mRNA的表达显著相关。6.转染rAAV-shRNA-LMP-1至鼻咽癌细胞株C666-1抑制LMP-1的表达后CXCR4mRNA的表达显著下调,提示LMP-1siRNA可在转录水平改变CXCR4的表达。7.鼻咽癌细胞高表达CXCR4,鼻咽癌易转移的远处靶器官高表达SDF-1α,CXCR4/SDF-1α可能参与鼻咽癌细胞趋向远处靶器官转移。