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第一章兔脑死亡肝脏差异蛋白表达趋势检测目的根据前期蛋白质组学技术筛选出的显著性差异蛋白Runx1,研究其在脑死亡肝脏中表达趋势变化。方法使用免疫组化、PCR、western blot在转录翻译水平验证Runx1蛋白在脑死亡肝脏中表达水平变化。结果免疫组化、RT-PCR、Western blot检测脑死亡后Runx1蛋白在肝脏中表达水平变化,发现随着脑死亡持续时间延长,Runx1蛋白呈下降趋势,在8小时时间点表达水平最低(P<0.05)。结论缓慢间断颅内加压法脑死亡后肝脏采用双向凝胶电泳和质谱分析,鉴定出Runx1蛋白表达水平在脑死亡前后肝脏细胞中有显著变化,该蛋白定位于细胞核内,是细胞增殖与分化相关蛋白质,随着脑死亡时间的延长,在肝脏中的表达逐渐减少,可能参与致肝脏损伤过程。第二章Runx1蛋白对缺血缺氧肝脏细胞作用的体外实验研究目的体外细胞实验探索Runx1蛋白对缺血缺氧肝脏细胞的作用。方法使用质粒为载体的全长度Runx1cDNA pEGFP-N1-RUNX1转染大鼠肝脏,使Runx1基因过表达；转染pEGFP-N1为阴性对照组,对质粒转染后的大鼠肝脏细胞进行缺血缺氧处理；实验分为四组：对照组(C组)、缺血缺氧组(IS)、转染阴性对照+缺血缺氧组(S+IS)、Runxl过表达+缺血缺氧组(OS+IS)。流式细胞仪检测各组大鼠肝脏的细胞凋亡率,检测TGF-β、Bcl-2、Bim、 TNF-α mRNA表达水平,研究Runxl蛋白对缺血缺氧细胞肝脏作用机制。结果pEGFP-N1-RUNX1转染大鼠肝脏细胞48小时后Rux1蛋白表达水平达到峰值。PCR和Western blot检测Runx1表达水平在IS组和S+IS组较对照组明显降低(P<0.05),在OS+IS组较对照组表达明显升高(P<0.01)。流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,IS组和S+IS组较对照组细胞凋亡明显升高(P<0.01), OS+IS组细胞凋亡率较IS组和S+IS组明显降低(P<0.05)。PCR检测大鼠肝脏细胞各组TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表达水平。在IS组、S+IS组、OS+IS组中,TGF-13mRNA表达水平全部升高(P<0.05),三组之间没有明显差异(P>0.05)。在IS组和S+IS组中,Bcl-2mRNA与C组相比表达水平显著降低(P<0.05),但两组间没有统计学差异(P>0.05), Bim、TNF-α表达水平显著升高(P<0.05)；在OS+IS组中Bcl-2mRNA表达水平明显升高(P<0.05), Bim、TNF-α mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。Runx1表达水平的改变引起了Bcl-2/Bim、TNF-α mRNA表达水平的显著改变,因此Bcl-2/Bim、TNF-α是受到Runx1蛋白调控的下游信号分子。结论体外细胞实验证实,肝脏细胞在缺血缺氧后,Runx1明显降低,TGF-β、Bim、TNF-α等细胞凋亡相关因子明显升高；采用pEGFP-N1-RUNX1真核载体转染方法可有效的使Runx1在转录和翻译水平表达增加。过表达Runx1后,TGF-β表达含量无明显变化,而Bcl-2、Bim、TNF-α等凋亡相关因子表达显著变化；过表达Runx1后细胞凋亡率显著降低,这与Runx1诱导凋亡抑制因子Bcl-2升高并使得促凋亡因子Bim、TNF-α表达降低有关。Runx1是通过调控Bcl-2/Bim家族表达,经线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡；同时,Runx1促进TNF-α表达,通过细胞外凋亡途径引起细胞凋亡；第三章Runx1蛋白对脑死亡大鼠肝脏细胞作用机制的在体实验研究目的通过脑死亡大鼠在体实验研究进一步证实TGF-β-Runx1-Bcl-2/Bim和TGF-β-Runx1-TNF-α信号通路对脑死亡肝脏细胞作用机制。方法高压注射质粒转染大鼠尾静脉pEGFP-N1-RUNX1,并实行脑死亡手术。将实验分为假手术组(C组)、脑死亡组(BD)、转染阴性对照+脑死亡组(S+BD)、Runxl过表达+脑死亡组(OS+BD).检测各组肝脏在2h、4h、6h、8h时间点ALT、AST水平和肝脏形态学变化,以观察各组肝脏功能损伤；PCR检测各组2h、4h、8h时间点Runx1、TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表达水平,验证Runx1对肝脏作用机制。结果高压注射质粒转染大鼠尾静脉pEGFP-N1-RUNX1在48小时后Runx1表达达到峰值,后逐渐下降。检测各组ALT、AST水平,与对照组相比,BD组与S+BD组ALT、AST的水平明显升高(P<0.05),但两组问相差无统计学意义(P>0.05); OS+BD组在各个时间点血清中ALT、AST水平较BD组与S+BD组降低,差异均具有统计学意义(P<0.01)。肝脏形态学检测显示,与BD组相比,OS+BD组各时间点肝脏细胞损伤程度均减轻PCR检测大鼠肝脏细胞假手术组(C组)、脑死亡组(BD)、转染阴性对照+脑死亡组(S+BD)、Runx1过表达+脑死亡组(OS+BD)中2h、4h、8h时间点Runxl、TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表达水平,GAPDH为参照。在各个时间点,脑死亡组(BD)、转染阴性对照+脑死亡组(S+BD)、Runx1过表达+脑死亡组(OS+BD)TGF-β mRNA表达水平升高,三组处理方式间无统计学差异(P<0.05)。在各个时间点与假手术组相比,脑死亡组(BD)、转染阴性对照+脑死亡组(S+BD) Bcl-2mRNA表达水平降低,Bim、TNF-α表达水平升高(P<0.05)；而Runx1过表达+脑死亡组(OS+BD),Bcl-2mRNA表达水平明显升高,而Bim、TNF-α表达水平降低(P<0.05),相对应肝脏形态学,肝脏细胞坏死凋亡面积减轻,炎症细胞浸润减少。结论Runx1在体大鼠脑死亡实验证实,Runx1在脑死亡肝脏中表达含量的降低,引起肝脏细胞凋亡增加；Runx1对肝脏细胞的作用是通过TGF-β-Runx1-Bcl-2/Bim和TGF-β-Runx1-TNF-α信号通路来发挥对缺血缺氧肝脏细胞作用的。Bcl-2/Bim、TNF-α受到Runx1的表达调控,是Runxl的下游靶基因。