细胞内活性分子,包括活性小分子和大分子,组成了机体复杂的调节网络,是各项生命活动的基础。其中,活性小分子包括活性氧（ROS）、金属离子、H⁺等,在细胞的信号转导过程中起着至关重要的作用,与生物体的生理、病理过程、老化以及多种疾病的发生发展密切相关。活性大分子包括核糖核酸（DNA）、脱氧核糖核酸（microRNA、tRNA、mRNA）和蛋白质等,在生物的生长、发育、炎症、癌症等多种生命活动中发挥着重要的作用。越来越多的研究表明,各种细胞和细胞器内的活性分子之间相互影响,相互协作,共同调控着细胞的功能,与多种疾病有着密切的关系。比如,过氧化氢（H₂O₂）和pH的异常变化会导致线粒体功能紊乱,而线粒体功能紊乱与神经退行性疾病和癌症等疾病相关。近期研究发现,在细胞自噬和凋亡过程中都会发生pH降低和超氧阴离子(O₂^·-)浓度升高的现象。同时,研究表明microRNA（miRNA）和H₂O₂的异常变化也和癌症、缺血再灌注损伤和心血管等疾病关系紧密。因此,发展有效的方法在活细胞和活体水平上同时监测多种活性分子的变化,对揭示它们在各种生理学和病理学过程中的互作具有重要的意义。荧光检测法与荧光成像技术具有灵敏度高、时空分辨率性好等优点,为实时、准确的检测活性分子提供了有力的工具。纳米荧光探针具有生物相容性好、易于进行化学、生物修饰等优点,在分析化学、生物学和医学等领域引起了人们极大的关注。尤其是近几年来,纳米荧光探针已经被广泛用于各种活性分子的检测,有力地推动了人们进一步理解活性分子在疾病的发生与发展中所发挥的作用。然而,目前报道的研究方法大多只是检测某一种活性分子,不能实现多种活性分子的同时测定,这极大地阻碍了对多种活性分子共同参与的病理学过程的深入研究。因此,使用单一探针实现多种活性小分子、多种活性大分子以及活性小分子和活性大分子的同时检测定将成为研究细胞中分子互作对细胞功能调控的重要途径。本论文设计合成了系列新型的纳米荧光探针,实现了细胞线粒体内pH/H₂O₂以及O₂^·-/pH同时荧光成像检测;可视化监测了活细胞和活体内miRNA/mRNA以及H₂O₂/miRNA的变化,并初步探讨了它们与酒精肝疾病和心脏缺血再灌注损伤之间的关系。具体包括:1.发展了一个新型线粒体靶向的荧光纳米传感器,利用荧光成像技术,实现活细胞的线粒体中H₂O₂和pH实时检测与成像。首先,将pH和H₂O₂特异性响应的分子荧光探针装载在小粒径的介孔二氧化硅（MSN）中,然后通过静电作用修饰聚乙烯亚胺封住MSN的孔洞。进一步通过酰胺键连接线粒体的靶向基团三苯基膦。所制备的纳米传感器能够特异性的靶向线粒体,并成功的实现了对活细胞线粒体内pH和H₂O₂波动的实时成像。所发展的纳米探针有望作为一种有效的工具来进一步探索活细胞内多个细胞器之间的相互作用。2.选用内核MSN装载参比染料罗丹明B,壳层二氧化硅（SiO₂）中掺杂pH和O₂^·-的荧光探针,再将壳聚糖以及三苯基膦修饰到壳层SiO₂的表面,构建了靶向宫颈癌细胞线粒体的纳米探针,实时、动态地监测了细胞的自噬和凋亡过程中pH和O₂^·-的变化的动力学过程。通过动力学数据解析,发现细胞自噬和凋亡初期pH值都是下降的,而O₂^·-在凋亡初期是上升的、自噬初期基本不变;在自噬和凋亡后期,O₂^·-都是上升,而pH值在凋亡后期基本不变、自噬后期是下降的。研究结果表明宫颈癌细胞自噬和凋亡过程中pH和O₂^·-的变化是有显著差异的,该研究结果对自噬和凋亡过程中O₂^·-和pH值对细胞功能的调控或相关疾病发生发展的研究将提供有用的信息。3.基于金纳米粒子（AuNPs）和分子信标（MB）设计了一种双色纳米荧光探针,此时荧光团的荧光被AuNPs猝灭。当脂肪肝相关的microRNA-155和脂肪性肝炎相关的骨桥蛋白mRNA存在时,相应的MB被打开,荧光得以恢复。发展的纳米探针和成像方法有效的预警了脂肪肝和脂肪性肝炎的发生,监测了脂肪肝向脂肪性肝炎实时转化及N-乙酰基半胱氨酸缓解酒精肝损伤的过程,为酒精肝疾病预警及治疗预后提供了新的策略。4.发展了一种复合纳米荧光探针实现活细胞和活体缺血再灌注损伤过程中microRNA（miRNA-21）和H₂O₂的同时检测与成像。复合纳米探针以二氧化硅@聚多巴胺-DNA1纳米粒子作为内核,CeO₂-DNA2纳米粒子作为卫星。当miRNA-21和H₂O₂存在时,DNA1和DNA2从纳米复合物释放下来,荧光恢复。实验结果表明,在H9C2细胞模拟的缺血再灌注过程中,H₂O₂能够通过PI3K/AKT信号通路调控miRNA-21的表达。在模拟的心脏缺血再灌注过程中,miRNA-21和H₂O₂都发生过表达。研究结果说明它们与心脏缺血再灌注损伤有着密切的关系,同时也说明miRNA-21和H₂O₂在心脏缺血再灌注损伤过程中确实存在着相互作用,为进一步探索ROS和miRNAs在其他病理学中细胞器互相作用研究提供新策略。