马度米星铵（maduramicin）是聚醚类抗生素的一种,因其具有抗球虫谱广、效价高、用量少、价格低廉、促进增重且球虫不易产生耐药性等诸多优点,广泛用于防治肉鸡球虫病。但其安全范围极窄,推荐剂量与中毒剂量非常接近,常导致靶动物肉鸡及非靶动物猪、牛、羊、兔和人的中毒,心肌和骨骼肌是其毒性损伤的靶器官,现有研究多见于中毒案例报道和临床病理组织学观察,其引起心肌和骨骼肌毒性损伤的机制尚不清楚,探究马度米星铵如何引起鸡心肌的损伤将为防控马度米星铵导致的肉鸡心脏毒性提供理论支撑,为促进该类药物的合理使用提供参考依据。为此,本文以鸡原代心肌细胞为体外研究模型,首先采用转录组学分析马度米星铵引起的差异表达基因,进一步利用生物信息学分析预测其毒性机制,细胞炎症反应、细胞凋亡、离子紊乱及胞浆空泡化可能是其主要机制,然后对预测机制进行了试验确证,进而阐明了马度米星铵通过巨泡式死亡和细胞凋亡引起鸡原代心肌细胞的严重损伤。主要研究内容如下:1.马度米星铵致鸡原代心肌细胞毒性的转录组学分析为系统揭示马度米星铵引起的鸡心肌毒性机制,本章以鸡原代心肌细胞为体外模型,采用RNA-seq在转录水平解析马度米星铵对鸡心肌细胞转录谱的影响,结合生物信息学分析预测其毒性机制。分别以0、0.05、0.1、0.5、1和5 μg/mL马度米星铵处理鸡心肌细胞24、48和72 h,CCK-8法测定细胞毒性,筛选最佳曝露方案用于RNA-seq分析;0和5μg/mL马度米星铵处理鸡心肌细胞24 h,提取总RNA,在Illumina Hiseq 4000平台进行测序,对原始数据进行过滤得到有效数据,与参考基因组进行比对,并采用FPKM法计算基因表达量;筛选差异表达基因并采用RT-qPCR进行验证,利用GO数据库对差异表达基因进行富集分析,采用KEGG数据库对差异基因进行功能注释。结果显示RNA-seq产生足够的高质量有效数据,与空白对照组比较,5 μg/mL马度米星铵处理鸡心肌细胞24 h共产生1442个显著差异基因,其中810条基因上调表达,632条基因下调表达;RT-qPCR证明RNA-seq所得差异表达基因准确可靠;GO富集结果显示差异基因主要富集到细胞质、能量代谢及胞浆内物质转运等多条生物功能条目;KEGG注释结果表明差异表达基因主要与细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞凋亡、钙离子信号通路及胞浆内空泡形成有关。结果提示,马度米星铵引起的鸡心肌细胞毒性作用可能主要涉及炎症反应、细胞凋亡、胞浆内离子紊乱等多条代谢途径的调控。2.转录组学分析结果的验证为进一步确定马度米星铵致鸡原代心肌细胞毒性的作用机制,本章重点验证RNA-seq和生物信息学分析结果的准确性,开展了一系列验证性试验阐释马度米星铵引起鸡心肌细胞死亡的发生机制。分离培养鸡原代心肌细胞,0～5μg/mL马度米星铵处理细胞12～24 h后,采用ELISA、流式细胞术、Western blot、比色法、透射电子显微镜等方法分析相关炎症因子释放、细胞凋亡、凋亡蛋白表达、胞浆Ca2+水平、Na+-K+/Ca2+-ATP酶活性和胞浆空泡化。结果显示:马度米星铵可以显著提高鸡心肌细胞促炎因子TNF-α和IL-8的释放（P<0.05）,马度米星铵呈浓度依赖性的增加细胞凋亡率（P<0.05）,并显著提高caspase-3的活性（P<0.05）。胞浆内Ca2+水平及心肌细胞Ca2+-ATP酶活性显著增加（P<0.01）,胞浆内过量的Ca2+来源于内质网钙库及胞外介质。马度米星铵导致鸡心肌细胞内空泡增加,空泡呈透明、单层膜、大小不一、基本不含胞浆内容物等特征。以上结果说明:炎症反应、细胞凋亡、胞内离子紊乱及胞浆空泡化共同介导马度米星铵引起的鸡心肌细胞毒性损伤。3.马度米星铵诱导鸡原代心肌细胞凋亡的机制为探究细胞凋亡在马度米星铵诱导鸡原代心肌细胞毒性中的作用,阐述细胞凋亡发生的机制。本章以原代培养的鸡心肌细胞为体外模型,20 μM的z-VAD-fmk和500 mM的NAC预处理细胞1 h后,不同浓度的马度米星铵（0、0.05、0.5和5μg/mL）处理细胞24～72 h,显微镜观察细胞形态改变;MTT法分析细胞活性;DAPI染色观察细胞核形态;Annexin V-FITC/PI染色后采用流式细胞仪检测凋亡率;RT-qPCR分析凋亡基因变化;比色法检测凋亡蛋白活性;JC-1染色后经流式细胞仪和荧光显微镜分析线粒体膜电位变化;DCFH-DA染色后荧光显微镜观察ROS改变;比色法测定胞内GSH的含量。结果显示:不同浓度的马度米星铵处理鸡心肌细胞24 h,细胞损伤严重且细胞活性下降显著（P<0.05）。马度米星铵诱导细胞凋亡率升高,同时caspase-3/8/9基因和蛋白表达水平显著上调（P<0.05）。细胞内线粒体膜电位显著降低（P<0.05）。细胞内ROS水平显著升高,GSH水平显著下降（P<0.05）。z-VAD-fmk预处理可在一定程度削弱马度米星铵诱导的细胞凋亡及鸡心肌细胞毒性。NAC预处理未能减弱马度米星铵引起的细胞凋亡但可降低细胞毒性。综上所述,caspase依赖和非依赖的细胞凋亡途径参与了马度米星铵诱导的鸡心肌细胞死亡,氧化应激加剧了马度米星铵引起的鸡心肌细胞毒性,抑制细胞凋亡和ROS产生一定程度上可削弱马度米星铵诱导的心肌细胞毒性。4.马度米星铵诱导鸡原代心肌细胞发生巨泡式死亡的机制非caspase依赖的细胞死亡方式存在于马度米星铵诱导的鸡心肌细胞毒性作用中,本章进一步解析马度米星铵诱导非凋亡性细胞死亡的形态学特征和分子机制,以期阐明马度米星铵致心肌细胞损伤的机制。以鸡原代心肌细胞为体外研究模型,0、0.05、0.5和5 μg/mL的马度米星铵处理鸡心肌细胞12～72 h,光学显微镜观察胞浆内空泡形态学特征,透射电子显微镜观察空泡的超微结构;以5 μg/mL的马度米星铵处理鸡心肌细胞12 h,采用激光共聚焦显微镜连续观察心肌细胞内空泡形成的规律;以Dextran 488-FITC、ER Tracker、Mito Tracker、Lyso Tracker等荧光探针染色马度米星铵处理12 h的鸡心肌细胞,激光共聚焦显微镜分析胞浆内空泡与胞浆内细胞器的定位关系。以z-VAD-fmk、3-MA、CQ及Bafilomycin A1预孵育鸡心肌细胞1 h,经不同浓度马度米星按处理12～24 h后,光学显微镜或透射电子显微镜观察空泡变化,CCK-8法测定细胞活性变化,琼脂凝胶电泳法观察DNA ladder是否形成,Western blot分析LC3-Ⅰ/Ⅱ、p62、H-Ras、K-Ras、Rac 1等蛋白的表达变化。结果显示,马度米星铵引起鸡心肌细胞出现浓度和时间依赖性的细胞质空泡化现象,胞浆内大量的空泡特征不同于细胞凋亡、自噬等的典型形态学特征,这种空泡来源于细胞巨胞饮,而不是线粒体、内质网或溶酶体的肿胀。z-VAD-fmk和3-MA/CQ不能抑制马度米星铵引起的鸡心肌细胞空泡化,亦不能保护心肌细胞活性（P>0.05）。而Bafilomycin A1可以显著抑制胞浆内空泡的产生且可以显著保护细胞活性（P<0.01）。马度米星铵可以影响LC3-Ⅰ/Ⅱ和p62蛋白的表达,但抑制表达后并不能改善马度米星按引起的细胞损伤。马度米星铵处理鸡心肌细胞后,K-Ras和Rac 1蛋白表达量均显著变化。上述结果表明,马度米星铵可引起不同于凋亡及细胞自噬的巨泡式细胞死亡,这种细胞死亡依赖空泡型H+-ATP酶的活化及Ras-Racl信号通路的参与。综上所述,本文发现马度米星铵可导致鸡原代心肌细胞的毒性损伤,引起鸡原代心肌细胞转录谱的显著改变;差异表达基因主要集中于细胞炎症反应、细胞凋亡、离子紊乱及胞浆空泡化;caspase依赖和非依赖的细胞凋亡途径介导了马度米星铵引起的鸡心肌细胞毒性,巨泡式细胞死亡-methuosis主导了马度米星铵的心肌细胞毒性作用。本研究完善了马度米星铵致鸡心肌损伤的机制,为兽医临床防控马度米星铵心脏毒性提供一定参考依据,具有重要理论和现实意义。