叶片早衰不仅导致玉米植株光合效率降低,光合产物减少,还能够显著的影响叶片发育后期营养元素从营养器官向生殖器官和贮藏器官中的转运,严重影响优良品种产量潜力的发挥。随着分子生物学研究的发展,使传统的育种策略与分子水平研究结果的结合成为可能。但是,由于叶片衰老相关基因表达网络以及调控机制尚不清楚,鉴定与筛选叶片衰老差异基因并深入探究玉米叶片衰老过程中复杂分子机理仍是当前分子育种研究的重点。本研究从两个叶片衰老极端表型玉米自交系ELS-1和豫87-1入手,分析早衰材料和持绿材料在叶片衰老不同时期的转录本、miRNA表达的动态变化以及差异表达的转录本和miRNA,探讨了在叶片衰老过程中差异转录本和miRNA在叶片衰老过程中的调控机理和分子机制。同时结合简化基因组测序技术,对玉米叶片衰老基因进行了初步定位分析。通过多平台的联合分析,综合筛选的差异表达基因和miRNA结果,初步解析叶片衰老过程的分子调控机制。主要研究结论如下:1、对两个自交系授粉后10天、20天、25天和30天植株叶片表型观察发现,叶片的衰老由底部叶开始,自叶尖、叶缘向内部扩展;此后,整个植株的叶片衰老由底部叶和顶部叶分别向中部叶片扩展逐渐衰亡,穗位叶最后衰老。叶绿素含量的降低是植物叶片衰老最直观的外在指标。在叶片衰老的后期,两个自交系穗位叶的叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素的含量均呈现下降的趋势,但是变化模式不同。与自交系豫87-1相比,早衰自交系ELS-1的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量在衰老后期急剧下降,并且在授粉后30天后含量极低。豫87-1中叶绿素a的表达在授粉后10-30天降幅较小,而叶绿素b在授粉后25天开始有所下降。2、基于高通量测序平台Illumina2500,分别构建了自交系ELS-1和豫87-1授粉20天和30天穗位叶转录本文库。测序结果表明,四个文库共获得16.09 Gb Clean Data,Q30均大于85%,有效数据量充足,测序标签在玉米B73参考基因组上的比对效率大于66%;以豫87-1为对照在衰老自交系ELS-1中共检测到1351个基因差异表达,上调基因881个(65%),下调基因470个(35%)。GO分子功能注释分析发现,差异基因主要富集到植物与病原体互作、植物激素信号传导互作、碳水化合物代谢、氮代谢、氨基酸代谢以及能量代谢等通路中。3、ELS-1和豫87-1授粉后20天和30天的miRNA深度测序结果显示,通过文库构建和数据过滤共获得了215,506 clean reads。以豫87-1为对照,在ELS-1中共得到了80个差异表达miRNAs,分属于26个已知的miRNA家族,有37个miRNAs在两个自交系的表达趋势一致,其中15个miRNAs在授粉后20-30天上调表达,22个miRNAs下调表达。此外,依据miRNA的序列和二级结构特征,鉴定出164个新的miRNAs。通过降解组测序分析miRNA靶基因,共获得了34个已知miRNA的106个靶基因。通过差异表达miRNAs靶基因的功能注释分析,zma-miR156、zma-miR159、zma-miR167、zma-miR171、zma-miR172、zma-miR395、zma-miR399、zma-miR408和zma-miR529等miRNA靶基因参与了玉米叶片生长发育、叶绿素降解、转录调控、信号传导和胁迫响应等过程。4、利用基于简化基因组测序技术(SLAF-seq)对玉米早衰性状BC1遗传分离群体(2个亲本和10+10的混池)进行重测序。选择玉米(Zea mays)B73基因组序列为参考基因组序列选择HaeIII+RsaI进行酶切,酶切片段长度为414-444bp,酶切效率为89.27%,四个文库共得到19.73M reads。通过生物信息学分析,获得165,127个SLAF标签,其中多态性SLAF标签有36,673个,多态性比例为22.21%。通过ED方法对多态性SLAF标签进行分析,在Chr3染色体上共关联到2个性状相关区域。对关联区域内的候选基因进行功能注释和生物通路富集分析,关联区域内参与脯氨酸代谢途径的候选基因GRMZM2G068665参与植物叶片衰老的调控。5、以转录组、miRNA的差异表达数据和SLAF的关联数据为基础,利用生物信息学的方法对不同数据平台差异表达的结果进行联合分析。联合分析发现,miRNA及其靶基因通过不同功能基因簇间共有的节点相互联系形成一个复杂的互作网络,共同参与叶片衰老的调控。其中miR399、miR529和miR159与SLAF中获得的脯氨酸代谢相关基因GRMZM2G068665相互作用,通过调节脯氨酸的生物合成途径,参与到玉米叶片衰老过程的调控通路中。