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研究背景和目的:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种恶性程度很高的肿瘤,也是最常见的肿瘤之一,肝癌在我国的发病率位居第3位,并呈现出逐年上升趋势,其死亡率也居于恶性肿瘤的前列。肝癌的病程进展很快,很多病人发现时手术已经难以切除,且其对放化疗均不敏感,肝癌患者的预后差,平均有效生存期极低。因而对肝癌的治疗仍是世界性难题,临床迫切需要寻找一种新的治疗手段。近年来,随着细胞生物学和肿瘤免疫学的快速发展,肿瘤免疫在肿瘤的发生、发展和治疗中的重要作用被证实,也发展出了如嵌合抗原受体修饰T淋巴细胞(chimeric antigen receptor-modified T cell,CAR-T)和免疫检查点抗体抑制技术等突破性的肿瘤免疫治疗新技术,这些新技术在临床治疗中显示出了非常好的疗效,为彻底治愈肿瘤带来了一线曙光。CAR-T技术,是指通过人工方法将可以特异性识别特定肿瘤抗原的单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)与可活化T细胞的受体胞内结构域融合成重组基因,随后将其高效表达于T细胞膜上的修饰技术。受CAR基因修饰的T淋巴细胞在体内外能高效特异地识别抗原阳性的肿瘤细胞,且不受MHC限制,并具有自我增殖和活化的能力,因而具有强大的肿瘤杀伤能力。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)是细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)。该蛋白在胚胎时大量表达于中胚层组织,在胎盘组织内也有表达。在正常成人体内仅有肾、肺及卵巢等器官有着极其微量的表达,而在其他正常的组织和器官如肝脏均未见GPC3蛋白的表达。GPC3与肝癌的发生发展有着密切的联系,不仅在肝癌的早期就有比较高的检出率,且随着肝癌病程的进展,其检出率也随之增高。因而,GPC3被认为是一种较为理想的HCC治疗靶点。因此,本研究拟以将靶向GPC3的单链抗体GC33与共刺激分子CD28、CD137和CD3ζ链的胞内信号结构域进行串联融合重组,构建anti-GPC3-CD28-CD137-CD3ζ的慢病毒表达载体,用以制备CAR-T细胞,并鉴定CAR分子在T细胞表面的表达情况,以及其对GPC3阳性肝癌细胞的杀伤效率,为GPC3阳性肝细胞肝癌的治疗探索出一条新的途径。方法:设计靶向GPC3抗原的CAR分子重组基因并构建p CDH-GPC3-CAR慢病毒表达载体,制备慢病毒感染T细胞;后采用流式细胞术、Western Blot、实时细胞监测和ELISA等技术,鉴定GPC3-CAR分子在T细胞上的表达效率以及CAR-T细胞其对GPC3阳性肝癌细胞的特异性的杀伤活性。结果:1.经过限制性内切酶酶切、DNA凝胶电泳和DNA测序证实慢病毒表达载体p CDH-CMV-GPC3-CAR-EF1α-cop GFP构建成功,并成功包装了慢病毒颗粒。2.成功分离了外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),应用慢病毒感染完成了对活化T细胞的基因修饰。流式细胞术和Western Blot检测均表明CAR分子成功表达于T细胞上。3.实时细胞分析表明CAR-T细胞能显著抑制GPC3阳性的Huh-7肝癌细胞的增殖,但是对GPC3阴性的SK-HEP-1肝癌细胞无明显的抑制作用。LDH释放试验证实CAR-T细胞对GPC3阳性的Huh-7细胞有直接杀伤作用。ELISA检测上清液中IFN-γ水平表明CAR-T细胞与Huh-7细胞共培养后,高效分泌IFN-γ。结论:靶向肝癌GPC3-CAR-T细胞具有高效分泌IFN-γ细胞因子,及特异性高效杀伤GPC3阳性肝癌细胞的能力,这为进一步推进GPC3-CAR-T临床前和临床转化研究奠定基础。