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研究背景酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是乙醇滥用相关的中毒性肝损伤性疾病,其可以从脂肪变性逐渐进展为肝炎、肝纤维化、肝硬化乃至肝细胞癌。研究发现,ALD不仅是肝纤维化的主要病因,也可以明显增加肝脏相关死亡的风险。目前,肝移植作为ALD唯一有效的治疗方法,受社会因素的影响,仅少数患者可以接受移植治疗且存在免疫排斥的风险。因此,探索一种ALD的新型治疗方式具有重要的临床意义。对酒精性肝损伤的大量研究发现,氧化代谢产物如活性氧(ROS),在疾病进展中发挥重要作用。NLRP3-caspase-1信号通路可被ROS激活并介导促炎细胞因子如IL-1β的释放。此外,Treg/Th17比例的失衡也参与ALD的发生、发展,通过恢复Treg/Th 17比值可以显著改善肝脏损伤。基于免疫调节和分泌活性,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,BMSC)已被广泛用于多种疾病的治疗,包括炎症性疾病等。骨髓间充质干细胞源性外泌体(mesenchymal stem cellderived exosomes,MSC-exosomes)作为一种纳米级囊泡,被认为是BMSC旁分泌因子的关键载体,其可以介导细胞间通讯并通过靶向传递囊泡内生物活性分子而发挥抗炎及免疫调节作用。最新研究发现,MSC-exosomes能够缓解移植物抗宿主病和药物性肝损伤等动物模型的组织病理改变。Nrf-2作为体内调节氧化应激的关键靶点,可调节一系列编码抗氧化酶及生物分子的防御基因,如HO-1,SOD和GSH等。但是,MSC-exosomes是否能够减轻乙醇诱导的肝损伤及其潜在的治疗机制有待进一步研究。本研究第一部分通过建立酒精性肝损伤小鼠动物模型,探讨ALD可能的发病机制,为后续研究提供简易、稳定的ALD动物模型和理论依据。第二部分成功分离提取MSC-exosomes,为进一步研究MSC-exosomes在ALD的发病机制及治疗中的作用提供了有力的实验基础。第三部分将MSC-exosomes移植入ALD小鼠,通过功能水平、细胞水平及分子水平的研究,观察对乙醇诱导的肝损伤的治疗作用,探讨潜在的机制,为其今后更好地应用于临床诊断和治疗的新靶点提供理论依据。第一部分酒精性肝损伤小鼠动物模型的建立目的:建立酒精性肝损伤(ALD)小鼠动物模型,探讨ALD可能的发病机制,为后续研究提供简易、稳定的ALD动物模型和理论依据。方法:将6～8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分成对照组与模型组。模型组中的小鼠用含有5%vol/vol乙醇的Lieber-DeCarli饮食喂养4周;对照组动物喂养同等热量的饲料。在喂养的第26,27和28天,模型组小鼠用乙醇(5mg/g)灌胃;对照组小鼠灌胃等热量的葡聚糖麦芽糖。实验结束后,收集血液和肝脏组织标本。用苏木精-伊红染色(HE)或油红O染色,观察肝组织病理学变化。检测各组小鼠ALT和AST水平,试剂盒分别检测血清IL-10、IL-17水平及肝组织SOD、GSH、MDA氧化应激指标。结果:(1)肝组织病理学变化:光学显微镜下观察,对照组小鼠整个肝组织无明显病理改变;HE染色显示,模型组小鼠肝细胞中出现脂肪空泡和脂质积聚,肝细胞点状坏死;油红O染色显示,模型组小鼠的肝脏组织中大量脂质沉积(脂质呈红色)。(2)血生化指标ALT、AST水平比较:与对照组比较,模型组ALT、AST水平均显著升高(均P<O.05)。(3)肝组织内SOD活性及GSH、MDA含量比较:与对照组比较,模型组小鼠肝组织内SOD活性及GSH水平均显著下降(均P<0.05),肝组织内MDA水平显著升高(P<O.05)。(4)血清细胞因子IL-10、IL-17水平比较:与对照组比较,模型组小鼠血清IL-10水平显著下降(P<O.05);血清IL-17水平显著升高(P<O.05)。结论:ALD的发病考虑为多因素共同作用的结果,目前其发病机制尚不完全清楚,其中氧化应激是ALD发病机制的中心环节。经Lieber-DeCarli饲养及乙醇灌胃后小鼠酒精性肝损伤模型成功建立。第二部分骨髓间充质干细胞源性外泌体的提取与鉴定目的:成功分离提取MSC-exosomes,为进一步研究MSC-exosomes在ALD的发病机制及治疗中的作用提供了有力的实验基础。方法:购买的C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(第六代)在37℃、5%C02的培养箱内用BMMSCs完全培养基培养。采用差速离心法抽提MSC-exosomes。收集无血清培养基,经过差速离心,将离心沉淀用200 μL的PBS重悬用于后续实验。将分离得到的外泌体用透射电镜和蛋白质免疫法进行鉴定。用BCA法测定外泌体中蛋白总量。结果:透射电镜下提取的MSC-exosomes呈现典型特征,即40～100 nm大小的杯状膜结构。蛋白印迹实验示MSC-exosomes表达阳性标志物CD63、CD81和TSG101,但不表达阴性标志物细胞色素C,符合外泌体的膜结构特征。结论:经超高速差速离心法成功分离MSC-exosomes。第三部分骨髓间充质干细胞源性外泌体对酒精性肝损伤的保护作用目的:观察MSC-exosomes移植对ALD小鼠的治疗作用,探讨潜在的治疗机制。方法:将6～8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分成对照组、模型组和外泌体组。模型组和外泌体组小鼠Lieber-DeCarli饲料饲养4周并在第26、27和28天分别进行乙醇灌胃,而对照组小鼠给与等热量的葡聚糖麦芽糖。外泌体组小鼠分别在实验第14和26天尾静脉注射MSC-exosomes进行治疗。实验结束后,收集血液和肝脏组织标本。用苏木精-伊红染色(HE)或油红O染色,观察肝组织病理学变化。检测各组小鼠ALT和AST水平,试剂盒分别检测血清IL-10、IL-17、IL-1β水平及肝组织SOD、GSH、MDA氧化应激指标,蛋白质免疫法用于检测核因子相关因子2(nuclear factor erythroid2-related factor2,Nrf-2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、核苷酸结合性寡聚区蛋白样受体 P3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)、Caspase-1 表达情况,实时定量 PCR 分别检测 IL-10、IL-17、Nrf-2、HO-1、NLRP3、Caspase-1 及IL-1βmRNA变化,流式细胞仪分析肝脏Treg和Th17数量。结果:(1)肝组织病理学变化:光学显微镜下观察,对照组小鼠整个肝组织无明显病理改变。HE染色显示,模型组小鼠肝细胞中出现脂肪空泡和脂质积聚,肝细胞点状坏死;油红O染色显示,模型组小鼠的肝脏组织中大量脂质沉积(脂质呈红色)。外泌体组小鼠肝脏脂质沉积明显减少,小叶结构完整,未见局灶性坏死。(2)血生化指标ALT、AST水平比较:与对照组比较,模型组ALT、AST水平显著升高(均P<O.05)。与模型组相比,外泌体组ALT、AST水平显著下降(均P<O.05)。(3)肝组织内SOD活性及GSH、MDA含量比较:与对照组比较,模型组小鼠肝组织内SOD活性及GSH水平均显著下降(均P<0.05),肝组织内MDA水平显著升高(P<O.05)。与模型组比较,外泌体组小鼠肝组织内SOD活性及GSH水平均显著升高(均P<O.05),肝组织内MDA水平显著下降(P<O.05)。(4)血清细胞因子IL-10、IL-17水平比较:与对照组比较,模型组小鼠血清IL-10水平显著下降(P<0.05),血清IL-17水平显著升高(P<O.05)。与模型组比较,外泌体组小鼠血清IL-10水平显著升高(P<O.05),血清IL-17水平显著下降(P<O.05)。(5)肝组织IL-10、IL-17mRNA水平比较:与对照组比较,模型组小鼠肝组织IL-10 mRNA水平显著下降(P<O.05),肝组织IL-17 mRNA水平显著升高(P<O.05)。与模型组比较,外泌体组小鼠肝组织IL-10 mRNA水平显著升高(P<O.05),肝组织IL-17 mRNA水平显著下降(P<O.05)。(6)肝组织Nrf-2、HO-1 mRNA水平比较:与对照组比较,模型组小鼠肝组织Nrf-2、HO-1 mRNA水平均显著下降(均P<0.05)。与模型组比较,外泌体组小鼠肝组织Nrf-2、HO-1 mRNA水平均显著升高(均P<0.05)。(7)肝组织NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA水平比较:与对照组比较,模型组小鼠肝组织NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA水平均显著升高(均P<0.05)。与模型组比较,外泌体组小鼠肝组织NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA水平均显著下降(均P<0.05)。(8)肝组织Nrf-2、HO-1蛋白表达比较:与对照组比较,模型组小鼠肝组织Nrf-2、HO-1蛋白表达均显著下降(均P<0.05)。与模型组比较,外泌体组小鼠肝组织Nrf-2、HO-1蛋白表达均显著升高(均P<0.05)。(9)肝组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达及血清IL-1β水平比较:与对照组比较,模型组小鼠肝组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达及血清IL-1β水平均显著升高(均P<0.05)。与模型组比较,外泌体组小鼠肝组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达及血清IL-1β水平均显著下降(均P<0.05)。(10)3.11肝脏Treg和TH17细胞占CD4+T细胞的比例比较:与对照组比较,模型组肝内Th17细胞占CD4+T淋巴细胞的比例显著升高,而Treg细胞占CD4+T淋巴细胞的比例显著下降(P<O.05);与模型组比较,外泌体组小鼠肝内Th17细胞占CD4+T淋巴细胞的比例显著降低,而Treg细胞占CD4+T淋巴细胞的比例显著升高(P<O.05)。各组肝内Treg/Th17比值比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:MSC-exosomes移植可以减轻乙醇诱导的肝损伤和脂质沉积。其可能通过恢复Treg和 TH17细胞的比例平衡,以及调节Nrf-2/HO-1 和NLRP3-caspase-1-IL-1β通路来降低肝内氧化应激和炎症水平发挥治疗作用。