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呋喃它酮(FA)和孔雀石绿(MG)属于我国水产养殖生产中禁止使用的兽药,这两种药物在动物体内分别被代谢为5-吗啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷酮(AMOZ)和隐孔雀石绿(LMG)。目前,已有针对AMOZ、LMG或它们衍生物的多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体的报道。FA和MG是水产品中经常检测的指标,制备针对2种药物的双特异性抗体能同时识别和结合2种对象,并用于建立多残留检测方法,显著提高现有单残留检测法的简便性和快捷性。目前尚未见抗AMOZ(或AMOZ衍生物)和LMG的双特异性抗体的研究报道。本文采用药物诱变方法构建了制备四体瘤的杂交体系,利用杂交–杂交瘤技术制备得到抗AMOZ衍生物和LMG的双特异性单克隆抗体(BsMAb),并建立了AMOZ-MG/LMG多残留ic-ELISA分析方法和AMOZ-MG/LMG残留总量ic-ELISA分析方法,主要研究结果如下:(1)酶缺陷型杂交瘤细胞株的诱导筛选分别利用梯度浓度的8-氮鸟嘌呤(8-AG)和5-溴尿苷(5-BrdU)对杂交瘤细胞进行诱导,筛选获得一株分泌抗AMOZ衍生物(3-NPAMOZ)单克隆抗体的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷型杂交瘤细胞株3-NPAMOZ-HGPRT-和一株分泌抗LMG单克隆抗体的胸苷激酶(TK)缺陷型杂交瘤细胞株LMG-TK-。采用ic-ELSIA法对诱导前后细胞培养上清进行了测定,结果表明诱导前后无明显差异。(2)BsMAb的筛选制备采用杂交-杂交瘤技术将两种酶缺陷型杂交瘤细胞3-NPAMOZ-HGPRT-和LMG-TK-进行融合,筛选出一株能稳定分泌抗AMOZ衍生物和LMG双特异性单克隆抗体的四体杂交瘤细胞4B10-5F1。采用小鼠腹腔诱生的方法获得含BsMAb的腹水,并采用辛酸-硫酸铵法和离子交换柱层析法依次分离纯化,纯化后的BsMAb纯度达到电泳纯。分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法、单克隆抗体亚型测定试剂盒及非竞争酶联免疫吸附分析法对BsMAb的分子量、抗体亚型和亲和力进行了鉴定,结果表明BsMAb分子量约为150 kDa,抗体亚型为IgG1型。BsMAb对AMOZ衍生物、LMG的亲和力常数分别为4.67×108 L/mol和3.60×108 L/mol。(3)AMOZ-MG/LMG多残留ic-ELISA方法的建立建立了AMOZ-MG/LMG多残留ic-ELISA方法,优化了包被原浓度、BsMAb稀释倍数、BsMAb稀释液、一抗竞争反应时间、酶标二抗稀释倍数、酶标二抗反应时间、药物稀释液和药物稀释液pH等检测条件。方法对AMOZ(以AMOZ的3-硝基苯甲醛衍生物3-NPAMOZ计,下同)的检测限为0.2 ng/mL,IC50为1.7 ng/mL,线性检测范围为0.4-8.3 ng/mL。方法对LMG的检测限为4.8 ng/mL,IC50为45.3 ng/mL,线性检测范围为7.0-291.7 ng/mL。除与呋喃它酮有32.6%的交叉反应率外,与其它类似物无明显交叉反应。检测草鱼和罗非鱼中AMOZ的添加回收率为72.4%-101.0%,变异系数均小于15%。ic-ELISA检测结果和HPLC-MS/MS检测结果线性相关系数达到0.97以上。检测草鱼和罗非鱼中MG、LMG及MG-LMG等量混合物的添加回收率为75.0%-108.0%,变异系数均小于15%。ic-ELISA检测结果和HPLC-FLD检测结果线性相关系数达到0.95以上。该多残留ic-ELISA方法可用于水产品中AMOZ、MG和LMG的同时检测。(4)AMOZ-MG/LMG残留总量ic-ELISA方法的建立建立了AMOZ-MG/LMG残留总量检测的ic-ELISA方法,优化了共包被浓度、BsMAb稀释倍数、不同3-NPAMOZ和LMG配比的标准曲线、BsMAb稀释液、一抗竞争反应时间、酶标二抗稀释倍数、酶标二抗反应时间、药物稀释液和药物稀释液pH等检测条件。方法建立中AMOZ被衍生化生成3-NPAMOZ,MG被还原生成LMG。该方法检测3-NPAMOZ和LMG残留总量的IC50为1.8 ng/mL,检测限为0.07 ng/mL,线性检测范围为0.2-14.5 ng/mL。除与呋喃它酮、3-NPAMOZ分别有32.8%和146.3%的交叉反应率外,与其它类似物无明显的交叉反应。草鱼中不同配比AMOZ-MG、AMOZ-LMG和AMOZ-MG/LMG混合药物的添加回收率范围为72.2%-107.0%,变异系数小于15%。ic-ELISA检测结果和HPLC检测结果(HPLC-FLD和HPLC-MS/MS)线性相关系数达到0.93以上。该方法可用于水产品中AMOZ、MG/LMG的残留总量的检测分析。