桑树(Morus alba L.)是一种重要的经济作物,不仅用作养蚕饲料,还是药食同源的植物。桑果不仅可以鲜食,还可以用来加工成果汁、果酱以及果酒;桑树的根、茎、叶、皮以及果实都有药用价值。研究表明,桑树中含有多糖、多酚以及生物碱等活性成分,具有降血糖、降血脂、抑菌以及抗肿瘤和抗衰老的作用。此外,桑树的根系比较发达,能在干旱、盐碱等贫瘠土壤下生长,可以作为生态树种,用来防风固沙、绿化荒山荒地等。因为桑树具有适应恶劣环境,抵抗逆境的特性,所以桑树抗逆特性的机理被广泛研究。研究表明多酚氧化酶是一种重要的防御酶。迄今为止,多物种(如番茄、茄子、苹果、梨子、葡萄和草莓等)的多酚氧化酶基因已经被克隆,其功能也得以研究报道。但桑树中多酚氧化酶基因未被克隆,其功能也没有被研究。因此克隆桑树中多酚氧化酶基因,并研究其抗逆功能和机制显得尤为重要。这将为提高桑树以及其他植物的逆境胁迫耐受能力提供重要参考信息。本研究利用生物信息学的方法鉴定了川桑(Morus notabilis C.K.Schneid.)基因组编码的5个多酚氧化酶基因,并通过酶活性分析和多酚氧化酶产物的抗微生物能力分析探究了桑树中多酚氧化酶的功能。为了探索多酚氧化酶在植物逆境胁迫过程中的分子调控机制,通过DNA pull down-MS的方法鉴定得到MnPPO1基因的上游调控转录因子MnMYB3R1,进一步采用酵母单杂、荧光素酶报告系统、染色质免疫共沉淀对MnPPO1基因的启动子区域和转录因子MnMYB3R1的互作进行了验证。通过表达模式分析和转基因烟草验证了MnMYB3R1转录因子参与调控多酚氧化酶基因的表达。研究所获得的主要研究结果如下:1、桑树多酚氧化酶基因的克隆和功能研究通过生物信息学的方法,在川桑基因组中鉴定到5个多酚氧化酶基因,分别命名为MnPPO1、MnPPO2、MnPPO3、MnPPO4、MnPPO5。并通过NCBI保守结构域分析对桑树多酚氧化酶的氨基酸序列进行了保守结构域在线预测,结果表明桑树多酚氧化酶均属于酪氨酸酶超家族,均具有完整的三型铜蛋白结合位点(CuA和CuB)。再分别对其进行亚细胞定位、信号肽、转运肽、以及跨膜等在线预测,结果表明桑树多酚氧化酶均不含跨膜区、不含信号肽,但都具有叶绿体转运肽以及定位在叶绿体中。通过qPCR分析了川桑叶片中5个多酚氧化酶基因在逆境胁迫处理后转录水平的变化。当植物处于生物(病原菌处理)或非生物胁迫(干旱处理)时,5个MnPPO基因的表达量都发生了变化。MnPPO1的表达量在干旱胁迫2 d时出现峰值,随后降低。而MnPPO2、MnPPO3、MnPPO4和MnPPO5的表达量在干旱胁迫4 d时才达到峰值,随后下降。且在干旱胁迫后,MnPPO1基因的表达上调量是桑树5个多酚氧化酶基因中最为明显的。灰霉菌处理8 h时,MnPPO3的表达水平达到最高值,而其余4个多酚氧化酶基因在灰霉菌处理24 h时达到最高表达量。且灰霉菌处理后,MnPPO1基因的表达上调量也是最为明显的。桑树5个多酚氧化酶基因在逆境胁迫下的表达模式暗示了其参与了抗逆境胁迫。通过原核表达,获取桑树多酚氧化酶蛋白,进一步通过酶活性实验确定了5个桑树多酚氧化酶属于酪氨酸酶,均具有单酚酶和双酚酶的活性。且绿原酸是桑树多酚氧化酶的最适底物。继而利用绿原酸作为底物,探索桑树多酚氧化酶与绿原酸反应产物对微生物生长的抑制效果。结果表明5个桑树多酚氧化酶的产物对大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和灰霉菌(Botrytis cinerea)均有一定的抑制作用,其中MnPPO1与绿原酸的反应产物显示出最佳的抑制效果,而MnPPO2的反应产物抑制效果最弱。2、MnPPO1与绿原酸反应产物的抗微生物机制利用MnPPO1与绿原酸反应的产物来研究桑树多酚氧化酶产物抗微生物机制。在本研究中,采用大分子渗透的方法来评估细胞膜的完整性。当MnPPO1的反应产物作用于大肠杆菌,绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌时,发现产物组的吸光度高于对照组。处理的上清液中吸光度的增加表明细菌细胞壁和/或膜损伤。实验结果表明,产物组中可溶性蛋白质含量低于对照组。通过检查细胞壁相关水解酶(如几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶)的活性来研究细胞壁的产物活性。在实验中采用双抗体夹心法测量2种真菌的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性。与对照组相比,MnPPO1产物添加组中的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性显著增加,表明MnPPO1产物增加与真菌细胞壁相关的水解酶活性,从而导致细胞壁降解。此外,通过透射电子显微镜检测测试菌的亚细胞结构变化。结果表明,未处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞显示完整的结构。然而,当MnPPO1反应产物作用于测试菌细胞8 h时,其亚细胞结构显著改变。大多数细菌细胞的细胞膜和细胞壁受损,细胞质不能保持均匀分布。此外,一些细胞的细胞质缺失,细胞已经空泡化。3、MnPPO1基因上游调控转录因子的解析克隆了MnPPO1基因上游2000 bp(-2000至+1区域,转录起始位点为+1)区域,并在其启动子区域鉴定到了与干旱相关的MYB转录因子结合位点、MSA元件、水杨酸和乙烯响应元件等。随后选取了MnPPO1基因上游1268 bp包含MSA的启动子区域作为模板,利用PCR法合成生物素标记的启动子探针用于DNA pull down实验,随后利用质谱鉴定生物素亲和捕获的蛋白质分子。鉴定结果得到一个R1R2R3型的MYB转录因子—MnMYB3R1。通过酵母单杂实验,荧光素酶报告实验以及染色质免疫共沉淀结合qPCR检测实验进一步证明了转录因子MnMYB3R1能通过MSA元件结合到MnPPO1基因的启动子上。通过在烟草中过表达MnMYB3R1基因以及胁迫缺水响应实验验证了MnMYB3R1转录因子调控PPO基因参与植物的缺水胁迫响应途径。实验结果表明在烟草中过表达MnMYB3R1基因,能增强烟草对干旱胁迫的耐受力以及多酚氧化酶活性的升高表明了MnMYB3R1转录因子正调控PPO参与植物干旱胁迫响应途径。