肾细胞癌(RCC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,约占恶性肿瘤的2-3%。由于缺乏典型的临床症状和早期肾癌的筛查标志,20-30%的肾癌在诊断时就已经发生转移,导致肾癌的预后不良。转移性肾癌对现有的治疗方式(放疗、化疗、IFN免疫治疗等)不敏感,且大部分患者在靶向治疗6-15月后对靶向治疗药物产生耐药,导致肾癌患者的5年生存率≦10%。因此,探索一新的肾细胞癌诊断、治疗方案已成为临床上亟待解决的问题。白花丹素(Plumbagin,PLB)是从植物白花丹根部提取的一种黄色结晶状萘醌类化合物。目前经体内、外实验已证实PLB具有抗过敏、神经保护、抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗细菌与真菌等多种药理学活性。此外,PLB对乳腺癌、肝细胞癌、前列腺癌等肿瘤的增殖、侵袭和转移均具有较强的抑制作用。PLB可通过多个分子靶点或信号通路(CDK1/CDC2、Cyclin B1、Cyclin D1、NF-KB,P53、P21、PI3K/AKT/m TOR、Ras、STAT3/PLK1/AKT和Wnt等)促进肿瘤细胞的凋亡、自噬以及细胞周期阻滞,同时也可抑制肿瘤新生血管的形成、侵袭和转移。迄今为止,PLB对肾细胞癌增殖、侵袭、转移的影响及其分子机制仍未见文献报道。微小染色体维持蛋白(MCMs)可作为细胞周期S期的调控因子,通过与染色体结合在DNA合成前表现出弱的解螺旋酶活性,调控细胞的增殖、细胞周期进程。MCM5位于22号染色体q13.1,是MCM家族的一员,在胃癌、肺癌、口腔鳞癌、恶性皮肤肿瘤、宫颈癌和膀胱癌等肿瘤中均显著高表达,并且与肿瘤的大小、TNM分期、病理分级、临床预后等显著相关。在肾细胞癌中,MCM2与肿瘤分级、新生血管的形成、总生存期(OS)有显著相关性,但是与年龄、性别、肿瘤大小以及TNM分期等无相关性。然而,MCM5在肾细胞癌中的差异表达及其在肿瘤进展、预后中的作用及机制仍不清楚。本研究中,为了进一步了解PLB对肾细胞癌是否具有治疗作用和MCM5在肾细胞癌发生、发展中的作用,我们研究了:(1)PLB能否抑制肾细胞癌的增殖、侵袭与转移。(2)PLB是否通过PI3K/AKT影响肿瘤的发生、发展。(3)MCM5在肾细胞癌中的差异表达及其在肿瘤发生、发展中的作用。(4)PLB是否通过MCM5抑制肾细胞癌增殖。第一部分:Plumbagin通过PI3K/AKT信号通路抑制肾细胞癌的增殖和侵袭转移目的:研究Plumbagin对肾癌增殖、侵袭和转移的影响,并且进一步明确Plumbagin对肾癌细胞PI3K/AKT信号通路的影响。方法:(1)根据Plumbagin浓度梯度分为0、1、5、10、20μmol/L,MTT检测Plumbagin对肾细胞癌增殖的影响并计算Plumbagin的IC50。将实验分为0、2.5、5.0、7.5umol/L四组,平板克隆检测Plumbagin对肾癌细胞克隆、增殖的影响,流式细胞检测Plumbagin对肾癌细胞凋亡的影响。Western blot检测Plumbagin对Bax、Bcl-2、Caspase-3等凋亡相关蛋白及PI3K/AKT通路相关蛋白的影响。(2)根据Plumbagin浓度梯度分为0、1.25、2.5、5.0μmol/L四组,划痕实验和Transwell检测Plumbagin对肾癌细胞侵袭、转移的影响。Western blot检测Plumbagin对TGF-β1、Smad3、E-cadherin、N-cadherin、MMP2、MMP9等侵袭、转移相关蛋白的影响。(3)将实验分为Control、5μmol/L Plumbagin、5μmol/L Plumbagin+IGF-1三组,MTT和平板克隆检测肾癌细胞增殖的变化,Western blot检测PI3K/AKT相关蛋白的变化。结果:(1)Plumbagin可呈浓度依赖性抑制肾癌细胞的增殖,诱导细胞的凋亡,此外可促进Bax、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9的表达,抑制Cyclin D1、Bcl-2的表达。(2)Plumbagin可呈浓度依赖性抑制肾癌细胞侵袭、转移。在Plumbagin的作用下,可抑制TGF-β1、Smad3、N-cadherin、MMP2、MMP9表达,促进E-cadherin表达。(3)Plumbagin组可显著抑制肾癌细胞的增殖,Plumbagin+IGF-1组较Plumbagin组对肾癌细胞增殖能力的抑制弱;Plumbagin显著抑制PI3K/AKT信号通路,然而IGF-1可部分逆转Plumbagin的抑制作用。结论:Plumbagin可通过PI3K/AKT信号通路抑制肾癌的增殖和侵袭转移。第二部分:MCM5促进肾细胞癌增殖并与肿瘤的进展、预后密切相关目的:研究MCM5在肾细胞癌中的差异表达及其在肾癌发生、发展中的影响。方法:(1)通过Oncomine在线数据分析MCMs在肾细胞癌中的差异表达,采用Linked Omics与Onco Lnc在线数据分析MCM5与肾细胞癌临床病理特点及预后的相关性。(2)通过免疫组织化学、Western blot检测MCM5在肾癌组织中的表达,进一步分析MCM5与肾癌临床病理特点的相关性。(3)通过病毒转染分别上调或下调肾癌细胞MCM5的表达,MTT、平板克隆检测肾癌细胞的增殖、克隆形成能力。通过构建裸鼠皮下成瘤模型,观察MCM5对肾癌生长的影响。结果:(1)采用Oncomine分析MCMs在肾癌组织中的差异表达,结果发现:MCM3、MCM4在肾癌及癌旁组织中表达无显著差异,MCM2、MCM5、MCM6、MCM7在肾癌组织中显著高表达,其中MCM5差异最大(Fold change=9.142,p=3.57E-12)。免疫组化、Western blot表明MCM5可在肾癌组织中显著上调。(2)利用Linked Omics与Onco Lnc在线数据分析发现,MCM5与肾癌的大小、TNM分期、总体生存期(OS)等临床病理特点密切相关。免疫组化分析进一步验证了MCM5与肾癌临床病理特点的相关性。(3)通过上调或下调肾癌细胞中MCM5表达,MTT、平板克隆结果显示:干扰MCM5可显著抑制肾癌细胞的增殖。裸鼠皮下成瘤实验表明:MCM5的下调可抑制肾癌的生长。结论:MCM5在肾癌组织中高表达,可促进肾癌细胞的增殖,在肾癌的发生、发展中发挥重要作用。第三部分:Plumbagin通过MCM5抑制肾细胞癌的发生、发展目的:研究MCM5是否参与介导Plumbagin在肾细胞癌增殖中的抑制作用。方法:(1)通过Western blot检测Plumbagin对肾癌细胞中MCM5蛋白表达的影响。(2)将实验分为Control、5μmol/L Plumbagin、5μmol/LPlumbagin+MCM5过表达三组,MTT实验检测各组中肾癌细胞增殖能力的变化。结果:(1)Plumbagin显著抑制肾癌细胞MCM5蛋白的表达。(2)Plumbagin可显著抑制肾癌细胞的增殖,与Plumbagin组相比,Plumbagin+MCM5组对肾癌细胞增殖的抑制作用较弱。结论:Plumbagin可能通过MCM5抑制肾癌细胞的增殖。