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背景创伤性颅脑损伤(TBI)有着较高的致死率和致残率,对人类的生命健康有着较大的威胁。中枢神经系统损伤后神经元再生能力较差。嗅鞘细胞(OECs)是一种具备持久分裂能力的细胞,可分泌多种神经营养因子,其中神经营养因子3(NT-3)具备促进神经元发育,维持神经细胞存活以及促进受损的神经元再生的功能。丙戊酸(VPA)能减轻神经细胞损伤,改善TBI大鼠神经功能的恢复。目的本实验运用慢病毒载体将NT-3基因转染入OECs内进行表达,探讨NT-3基因转染OECs的可能性及OECs-NT-3分泌的NT-3的生物学活性;通过构建的基因工程细胞OECs-NT-3联合应用VPA对TBI大鼠进行干预,探讨其对颅脑损伤的神经保护作用与机理,为TBI的临床干预提供动物实验研究资料。方法1.OECs的原代培养及鉴定:取妊娠约14 d的雌性SD大鼠,麻醉后,取出胎鼠,分离嗅球,进行OECs原代培养,应用差速贴壁法纯化OECs。运用免疫荧光技术鉴定OECs。2.OECs-NT-3基因工程细胞的制备:用包装有NT-3基因的病毒液感染OECs,同时建立对照(设未转染组、空载体转染组),应用荧光显微镜分析转入基因的表达情况。同时收集各组4 d、8 d、12 d、16 d、20 d、24 d、28 d的细胞上清,运用ELISA技术检测各组不同时间点上清中NT-3的含量。3.实验分组及处理:将50只健康雄性SD大鼠按随机数字法分为5组:假手术组、TBI模型组、OECs治疗组、OECs-NT-3治疗组、VPA联合OECs-NT-3治疗组,每组10只。除假手术组外,其余4组分别于脑损伤灶深入3 mm处注入生理盐水、OECs细胞悬液、OECs-NT-3细胞悬液、OECs-NT-3细胞悬液,VPA联合OECs-NT-3治疗组给予VPA腹腔注射,其余各组予等量生理盐水。4.相应干预后1、7、14、21、28 d进行大鼠神经系统疾病严重程度(NSS)评分;应用HE染色、嗜银染色对脑组织进行形态学观察;运用NF免疫组化观察神经细胞轴突排列情况;运用P75、GFAP免疫组化染色检测OECs的存活状态;应用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)对大鼠神经细胞凋亡状况进行观察。结果1.在细胞培养第10 d,进行OECs免疫荧光鉴定,观察OECs形态。计算OECs的纯度为(92.030±2.168)%。2.于转染后第4 d,对转染细胞进行免疫荧光观察。结果显示MOI值为20时转染效果最佳;计算慢病毒对OECs感染率为(70.686±10.291)%。3.ELISA结果显示:转基因组上清液中NT-3含量显著高于未转染组与空载体组,该结果可持续到转染后28 d。转基因组NT-3浓度在8 d左右达到峰值。4.术后21 d和28 d,OECs-NT-3治疗组较模型组和OECs治疗组NSS评分显著降低(P<0.05),VPA联合OECs-NT-3治疗组较OECs-NT-3治疗组显著降低(P<0.05)。5.VPA联合OECs-NT-3治疗组皮质区细胞排列较其他各组规整,可见更多细胞核膜较完整、细胞核仁较清晰的神经细胞。VPA联合OECs-NT-3治疗组NF免疫组化阳性轴索排列更为整齐,均优于OECs治疗组,OECs-NT-3治疗组。6.OECs治疗组、OECs-NT3治疗组、VPA+OECs-NT-3联合治疗组均可见P75、GFAP染色阳性结果,提示移植的OECs可以在SD大鼠体内存活。7.嗜银染色可见神经元轴突及神经纤维呈黑色,OECs-NT-3治疗组和VPA+OECs-NT-3联合治疗组情况优于单纯OECs治疗组。对正常结构的神经纤维计数并与大鼠NSS评分进行相关性分析,结果显示神经纤维数与NSS评分呈负相关(r=-0.904)。且两者的相关性具有统计学意义(P<0.05),说明正常形态的神经纤维数目越多,其相应的神经功能恢复状况也越好。8.TUNEL法检测各组大鼠脑组织内神经细胞的凋亡情况:OECs-NT-3治疗组、VPA+OECs-NT-3联合治疗组与单纯的OECs治疗组比较,凋亡细胞明显减少(P<0.05);VPA+OECs-NT-3联合治疗组与OECs-NT-3治疗组比较大鼠脑组织内细胞凋亡较少(P<0.05)。结论1.OECs的原代培养可通过差速贴壁法进行纯化,且纯化后OECs的纯度可达到进一步的实验要求。2.通过慢病毒载体可以成功将NT-3基因导入OECs,并在OECs内稳定表达NT-3。3.VPA联合NT-3基因修饰的OECs移植能有效改善TBI大鼠的预后。