研究背景与目的平滑肌是尿道的主要功能成分。平滑肌细胞是一种终末分化细胞,一旦受损后很难再生,而且也缺乏合适可替代的肌体组织,因此修复长段尿道的缺损一直是临床上的难题。有些研究者尝试通过脉管系统活检获得平滑肌细胞,然后在体外培养扩增细胞,制备具有机械性能和收缩功能的组织工程肌肉组织。然而这些成熟的平滑肌细胞在体外增殖能力有限,而且多次分化后,容易失去其收缩能力。最为重要的是,体外培养出来的平滑肌排列无规律,因此细胞收缩时,所有细胞不能朝同一方向收缩,难以实现平滑肌细胞群整体的收缩功能。通过组织工程的方法来制备功能性的尿道,需要解决的两个重要的问题就是寻找到理想的种子细胞和合适支架材料,进而培育出具有方向性排列的平滑肌细胞群。干细胞是一类处于未分化状态的细胞,它们具有自我更新能力,而且在一定条件下,能向多种成熟细胞类型分化。尽管胚胎干细胞(ESCs, embryonic stem cells)具有多向分化的潜能,但受伦理、宗教、道德和法律的制约,它们的使用受到限制。自成体组织来源的成体干细胞就不受这些因素的制约,而且因为可以从自体组织取材,能避开免疫排斥反应。脂肪干细胞(ASCs, adipose-derived stem cells)就是一种存在于机体脂肪组织的成体干细胞,它们能够比较容易的从脂肪组织提取,而且体外培养时,显示了很强的增殖能力和向多种细胞类型分化的潜能。例如向脂肪、骨、软骨、骨骼肌、平滑肌组织分化。而且ASCs具有易于大量获得、取材方便的优点,因此可作为用于尿道重建组织工程的“种子细胞”。良好的生物材料支架植入机体后,能够与细胞、机体组织和谐共存。种子细胞与支架材料在体外共培养后,植入体内受损组织部位,能够对机体大块组织缺损进行修补。支架材料分为非可降解材料和可降解材料两类。非可降解材料不能被机体吸收而留在体内,往往不能很好的替代机体组织的功能,如自我更新,新陈代谢及自我优化能力等。可降解材料能对受损组织进行形态、结构及功能上的修复,它们降解为对机体无毒害的CO2和水分子,仅留下支架材料上搭载的细胞与组织融合。本实验所用的PLLA/PCL材料(聚乳酸/聚己内酯)是可降解的聚乳酸(Poly L-lactide, PLLA)和聚己内酯(Polyε-caprolactone, PCL)的共混,通过调整两者的比例可以控制合成材料的柔韧性、伸展性和降解时间,因而制备出组织修复与重建理想的可降解生物支架。本课题应用PLLA、PCL作为原材料,应用静电纺丝技术制备具有方向性的纳米纤维细胞支架,并采用不同细胞外基质来改良材料的粘附性能,体外将自体ASCs在纳米支架上诱导为平滑肌细胞,以期在体外构建出具有整体收缩功能的平滑肌细胞群移植物。实验中研究了不同组份材料与细胞及组织的生物相容性,细胞外基质对材料细胞亲和力以及ASCs向SMCs分化的影响。而且成功将ASCs诱导为平滑肌细胞(AD-SMCs)后,将带AD-SMCs支架接种于兔尿道缺损模型,比较移植前后兔尿道压变化,为探讨ASCs结合方向性PLLA/PCL纳米纤维支架构建功能性尿道的可行性打下了实验基础。材料和方法一. ASCs分离、培养、鉴定和PLLA/PCL纳米纤维支架筛选。1.ASCs的分离及培养采用从新西兰大白兔(雌、雄各半)腹股沟区皮下脂肪、颈背部皮下脂肪、肾脏周围脂肪组织分离出的ASCs作为实验细胞。ASCs分离技术参照Zuk的方法：将兔不同部位取材的新鲜脂肪组织(约1.5g)置入无菌PBS液冲洗后,在含10%FBS的DMEM中剪成1-2mm碎块；无菌PBS反复洗脱,去除混杂的血细胞和脂肪细胞；置于振荡器内,37℃下0.1%胶原酶消化2小时；等体积含10%胎牛血清的DMEM培养基中止胶原酶反应；250g离心10分钟,取下层细胞团块；含有10%胎牛血清的DMEM培养基分散细胞团块,将细胞浓度调整至1*106/ml后移入无菌培养瓶中；37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养。2.ASCs鉴定流式细胞仪检测体外培养ASCs表面的干细胞标记性分子CD106、CD166；细胞免疫组织化学检测CD31、CD45、CD105。3.不同部位ASCs体外增殖能力的比较MTT法检测从腹股沟区皮下脂肪、颈背部皮下脂肪、肾脏周围脂肪组织分离出的ASCs第2代细胞第1、2、3、4、5、6、7天的增殖情况,比较三个不同部位来源ASCs增殖能力的差异。4.PLLA/PCL纳米纤维支架的制备利用静电纺丝的方法制备PLLA/PCL纳米纤维支架。参考Ma的方法,基本步骤如下：取10ml的20%的PLLA/PCL氯仿溶液,加入20ml的注射器,注射器由气泵匀速推注(0.5ml/h),使溶液通过一20G(内径0.21mm)的针头。在针头与接收纳米纤维的铝片之间(距离20-40cm)加高电压(15kv),这样PLLA/PCL氯仿溶液就会从针头高速喷出。在其向接收装置运动的过程中,溶剂氯仿迅速蒸发,铝片上收集到飘落的PLLA/PCL纳米纤维。当接收纳米纤维的铝片改为一匀速旋转的接收装置(铝盘)时,纳米纤维便能以一定的方向排列在铝盘上(图-1)。铝片上PLLA/PCL纳米纤维丝聚集到一定厚度(0.2-0.4mm)时收集材料。扫描电镜将用于纳米纤维的形态观察。这一部分主要在我校主校区,在课题合作单位华中科技大学化学系高分子材料实验室完成,合作者提供技术指导和设备、人员的支持。4.材料的细胞毒性与筛选腹股沟来源ASCs在不同比例PLLA/PCL纳米纤维支架上培养,免疫荧光活死细胞染色(Live/Dead Stain)检测材料的细胞毒性、免疫荧光染色及扫描电镜比较细胞在不同材料上的粘附、增殖差异。5.材料的组织相容性及材料体内降解检测将不同比例无菌材料种植于SD大鼠鼠背皮下,免疫组化检测不同时间材料种植部位炎症标志因子CD31、CD45、CD68表达情况,评估大鼠对材料的炎症反应以及观察材料的形态变化,了解材料在体内的降解情况。二.细胞外基质(extracellular matrix, ECM)改良PLLA/PCL纳米纤维支架性能。1.不同ECM(明胶、胶原、层粘连蛋白(LN)、纤维链接蛋白(FN)、高浓度多聚赖氨酸、低浓度多聚赖氨酸)处理96孔板及1:1 PLLA/PCL纳米纤维支架,MTT法检测不同ECM处理前后,96孔板中细胞增殖能力变化；免疫荧光染色及扫描电镜比较支架材料不同ECM处理前后,细胞粘附能力变化。2.不同ECM(明胶、胶原、层粘连蛋白(LN)、纤维链接蛋白(FN)、高浓度多聚赖氨酸、低浓度多聚赖氨酸)预处理培养皿后种植ASCs,在平滑肌诱导培养基(smooth muscle inductive medium, SMIM)中诱导ASCs向平滑肌方向分化。RT-PCR和Realtime-PCR检测不同时相,普通培养皿和ECM处理培养皿内诱导细胞平滑肌特异性标记基因(Calponin、SM22、α-SMA、MHC)mRNA的表达及表达量的变化；Western blot检测其蛋白质的表达水平。进而比较不同ECM对ASCs向平滑肌方向分化的影响。三.方向性PLLA/PCL纳米纤维支架上ASCs成平滑肌分化及兔尿道重建。1.制备具有方向性的PLLA/PCL纳米纤维支架,扫描电镜检测材料的方向性。2.ASCs与方向性的PLLA/PCL纳米纤维支架在普通培养基(DMEM)中共培养,免疫荧染色、扫描电镜及MTT法检测材料上细胞的粘附、增殖。3.ASCs结合使用或不使用LN预处理的PLLA/PCL内米纤维支架在平滑肌诱导培养基(SMIM)中共培养,扫描电镜观察LN处理前后,ASCs的粘附、分化及诱导出的平滑肌(AD-SMCs)的排列。4.兔尿道狭窄模型的建立及带细胞支架兔尿道修复应用钬激光在直视下对兔尿道行破坏,术后3-4周逆行尿路造影显示尿道狭窄形成。从该兔腹股沟区取脂肪组织,分离出ASCs并在体外培养增殖。将扩增的细胞种植于方向性纤维支架上,普通培养基(DMEM)内培养一周,细胞增殖密集后,换用诱导培养基(SMIM)诱导ASCs向平滑肌分化。成功诱导ASCs为AD-SMCs后,将带细胞支架移植于ASCs来源兔尿道内,不同时间点检测兔尿道压变化(2周、8周),并与尿道狭窄模型建立前,兔尿道压相对比,评估带细胞支架的治疗效果。结果1.从兔三个不同部位分离出的细胞都具有脂肪干细胞典型的三角形或梭形外观,流式细胞仪检测细胞表面CD106、CD166阳性率同脂肪干细胞吻合。2.不同部位ASCs体外增殖能力MTT法检测,差异有显著性(P<0.05)。颈背部增殖能力最强,其次为腹股沟区,腹膜后脂肪来源(肾周脂肪)增殖能力最弱。3.电镜下观测静电纺丝技术成功制备出具有方向性的纤维支架材料。4.免疫荧光活死细胞染色(Live/Dead Stain)检测,不同组分PLLA/PCL纳米纤维支架均无明显细胞毒性。免疫荧光活死细胞染色和扫描电镜观测不同时间点(1、2、3天)固定面积视野细胞计数,1：1支架材料细胞粘附能力最强,不同材料上细胞增殖能力没有明显差异(P>0.05)。5.不同支架材料种植与SD大鼠背部皮下后,第5天、第2、3、4、6、8、12周免疫组化染色。仅仅第5天时,炎性因子CD31、CD45、CD68有阳性表达,第2、3、4、6、8、12周免疫组化检测炎症因子CD31、CD45、CD68均无明显阳性表达,并观察到材料逐渐破碎降解,第12周时,基本看不到组织中材料成分,而且材料种植部位无肉芽组织形成。6.倒置像差显微镜下,计数不同ECM处理材料(1：1材料)后,相同面积材料上粘附的细胞数与未用ECM处理材料上细胞数对比,ECM处理后各组相同面积材料粘附数与未处理组有明显差异(P<0.05)。7.不同ECM处理培养皿中细胞增殖能力与未处理培养皿中细胞增殖能力对比,PLL高浓度组、PLL低浓度组、FN组与对照组有明显差异(P<0.05)；明胶、胶原、LN处理组与对照组无明显差异(P>0.05)。8.不同ECM处理培养皿后接种ASCs,在诱导培养基中诱导6周。Realtime-PCR检测显示不同ECM处理组,平滑肌特异性基因表达水平均随诱导时间延长而升高,6周时各种处理因素平滑肌特异性基因表达水平达到基本一致水平(成功诱导为SMCs)。LN、明胶、胶原能加速平滑肌细胞特异性基因表达。平滑肌细胞Western blot检测显示LN、明胶、胶原组诱导2w检测出calponin;FN、PLL(高、低浓度)、对照组2w未检测到calponin。明胶、胶原、LN、正常对照组细胞诱导3w检测SM22;PLL(高、低浓度)、FN处理组未检测出。PLL(高、低浓度)、FN、胶原、LN、明胶组细胞诱导4w检测出α-actin。PLL(高、低浓度)、明胶、胶原、LN、FN组细胞诱导6w检测出MHC蛋白表达。9.静电纺丝技术结合电转制备1:1 PLLA/PCL纳米纤维支架,扫描电镜下观察支架上纳米纤维具有一致的方向性。10.普通培养基中培养一周,免疫荧光染色、扫描电镜检测到1：1方向性PLLA/PCL纳米纤维支架材料上细胞数量逐渐增加。11.1：1方向性PLLA/PCL纳米纤维支架材料上细胞在诱导培养基(MCDB131)中培养6周时,扫描电镜检测显示支架材料上细胞排列具有方向性。细胞长轴方向与支架材料上,纳米纤维方向相同。12.钬激光在直视下对家兔尿道进行冲击,术后3-4周兔尿道造影检查可见尿道狭窄形成。将带AD-SMCs的支架植入ASCs来源的兔尿道,第2周与第8周检测兔尿道压,第2周时兔尿道压显示存在尿道狭窄,第8周时,部分兔(2/4)显示正常兔尿道压。结论1.腹股沟区来源ASCs取材容易且增殖能力强,是合适的ASCs来源。2.1:1 PLLA/PCL纳米纤维支架无细胞毒性、细胞粘附性好、组织炎症反应小,是合适的生物支架。3.ECM能改良材料的粘附性；LN、明胶、胶原能促进ASCs向平滑肌细胞分化。4.1：1方向性PLLA/PCL纳米纤维支架上能培养出具有方向性的平滑肌细胞。5.带细胞支架移植入兔尿道后,诱导出的平滑肌细胞能存活并且实现了整体的收缩功能。6. ASCs结合方向性PLLA/PCL纳米纤维支架构建功能性尿道具有可行性。