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胃癌细胞的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是胃癌化疗失败的主要原因。国内外已经发现的耐药相关分子(诸如P-gp、MRP、LRP、BCRP、GST、PKC、TopoII等)尚不能完全解释胃癌的MDR，提示胃癌细胞中存在着未知的耐药分子和耐药机制。MGr1-Ag是本研究所借助杂交瘤技术在胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR上发现的耐药相关分子。先前的研究证实，MGr1-Ag在SGC7901／VCR细胞的表达明显高于亲本细胞SGC7901，MGrl单克隆抗体可部分逆转SGC7901／VCR细胞的多约耐药性，并显著增加阿霉素在SGC7901／VCR细胞内的蓄积。分离MGr1-Ag的编码基因，深入探讨MGr1-Ag的功能及其作用机制，将有助于全面理解胃癌MDR的发生和调节机制。 目的：克隆、鉴定MGr1-Ag的编码基因，对其进行功能分析，并探讨其作用机制。 方法：(1)借助蛋白质双向电泳、Western blot和免疫酶印迹实验，对MGr1-Ag的部分理化性质和免疫学特性进行鉴定。(2)利用MGr1单克隆抗体筛选cDNA文库，通过PCR从阳性噬菌体DNA中扩增阳性cDNA片段，并对其进行序列测定和基因同源性分析。(3)通过反向RNA杂交和Northern blot检测阳性cDNA片段在胃癌细胞中的表达。(4)将侯选cDNA片段克隆入原核表达载体，并在大肠杆菌体内进行表达。(5)利用SDS-PAGE分离原核表达产物，并以纯化的表达产物为免疫原免疫小鼠，制备抗血清。(6)以MGr1抗体为对照， 第四军医大学搏士研究生论文用 Western blot鉴定制备的抗血清。（7）利用 DNA重组技术构建 MGrlAg基因的反义RNA 表达载体，在脂质体的介导下将其转导入胃癌耐药细胞SGC7901／VCR，用 Western blot检测 MGrlAg在基因转染细胞及其对照细胞中的表达。（8）借助流式细胞仪对基因转染细胞及其对照细胞进行细胞周期分析，并计算细胞的增殖指数（proliferous index，PI）。m通过 MTT实验进行体外药物敏感性分析，计算细胞对药物的 IC扣值和耐药指数k 川CC ind肛，RI人侧借助流式细胞仪检测细胞内蓄积和浇留的阿霉素。of）通过体外转录懈译观察待测基因的表达产物，并利用 Weste。blot对其进行检测。OD利用生物信息学对待测基因进行分析和预测。 结果：O）将SGC7901／VCR细胞的总蛋白经双向电泳分离后电转移至NC膜上，用MGrl单克隆抗体检测发现，MGrlAg的表观分子量约为42KDa，等电点约为4．8。m 免疫酶印迹实验表明，受胰蛋白酶或胄蛋白酶处理后，MGrlAg丧失了与MGrl抗体结合的能力，而过碘酸钠不影响MGrlAg与MGrl抗体的结合。（3）用 MGrl抗体对 cDNA文库中的 2．IX 10‘个噬菌体克隆进行了筛选，共获得22个阳性克隆。（4）对22个阳性CDNA片段（依次命名为RIR22）进行序列测定和同源性分析，结果发现，它们归属于12个基因；根据MGrlAg编码基因所表达的多肚链的理论分于量不应超过42KDa可知，12个基因中只有R7／Rg／RIS／RI6／R19ffe20所代表的人67KDa层粘连蛋白受体前体蛋白（human67KDa lamlnln receptor precursor，LAMRP）、R10／R12／R13（未知基因）、R18（术知基因）、R22（未知基因）可以作为MGrlAg的侯选编码基囚。（5）反向RNA杂交结果显示，R12和 R18在 SGC7901／VCR中的表达强度低 T SGC7901细胞，Rg、R15、R22在SGC7901／VCR中的表达强度高于SGC790！细胞；由丁己知MGrlAg 在SGC7901／VCR 细胞的表达高于SGC7901 细胞，所以将R7／Rg／R15／R16／R19／R20（LAMRP）基因和 R22基因确定为 MGrl－Ag的侯选编码基因。（6）以 R20和 R22 CDNA片段的原核表达产物为免疫原成功制备了相应的抗血清；以 SGC7901／VCR细胞总蛋白为靶抗原的 Western hi吐结果显示， －3－ 第四军医大学博土研究生论文一抗R22血清识别一条6lKDa的蛋白带，而抗R20血清与MGrl抗体识别相同的蛋白带。（7）Western blot 结果证实，R20 反义 RNA 表达载体转染SGC7901／VCR细胞后降低了MGrlAg的表达。（8）流式细胞仪检测结果表明，转染R20反义RNA表达载体的SGC790llVCR－anR20细胞增殖速度明显减慢，出现了自发性凋亡，细胞内蓄积和储留的阿霉素也有所增加。m体外药物敏感性分析结果显示，与转染空载体和未转染基冈的对照细胞相比，SGC7901／VCR－anR20细胞对K春新碱、阿霉素、5，氟尿啼吠、顺铂的敏感性显著升高。（卿 Northern blot结果显示，R22基冈的mRNA大小约为 1．Ikb，它在SGC7901／VCR的表达强度明显高丁SGC7901细胞；RNA点杂交表明，R22反义RNA表达载体转染降低了R22基因在SGC7901／VCR细胞的表达；体外药物敏感性分析结果显示，与转染空载体和术转染基冈的对照细胞相比，转染R22反义RNA表达载体的SGC7901／VCR－anR20细胞对丝裂霉素、5－氟尿啼咤、顺铂的敏感性显著升高；体外翻译结果显示，R22表达出了 38 KDa、35 KDa、3lKDa三条蛋白带，其中前两条蛋白带可以被抗R22血清识别；生物信息学分析结果显示，R22含有一个能翻译出263个氨基酸残基的开放读框?