第一部分:ESR1基因启动子甲基化在慢加急性乙型肝炎肝衰竭病情评估中的研究研究背景慢加急性乙型肝炎肝衰竭(Acute-on-chronic hepatitis B liver failure,ACHBLF)是指在慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)的基础上,短期内出现急性或亚急性的肝功能损害,主要表现为极度乏力、高胆红素血症、凝血功能障碍、失代偿性腹水和肝性脑病,严重危及患者的生命健康。ACHBLF进行性发展,出现多器官功能衰竭,短期内死亡率极高。早期诊断ACHBLF,在适宜的时间点采取恰当的干预手段有可能降低ACHBLF的发病率和死亡率。虽然终末期肝病模型(Model for end-stage liver disease.MELD)已成为现阶段得到广泛应用的精确评估肝病严重程度的评分系统,但此标准建立在肝硬化基础之上,不是特异性的针对HBV感染所致的肝衰竭,而且用于ACHBLF患者的预后判断时准确性下降,因此急需寻找一种可以在ACHBLF发展的早早期阶段就可以精确判断其预后的标记物。临床实践发现,ACHBLF的发病率在男性患者远远高于女性,这种性别差异可能是由于雌激素表达减少或是对雌激素的反应性降低所致。在肝脏,雌激素只有与雌激素受体(Estrogen Receptor,SR),尤其是ESR1结合后才能发挥延缓肝细胞凋亡、改善肝纤维化、抑制肿瘤生长的生物学功能。HBV可以促进宿主ESR1基因的高甲基化,ESR1达降低,诱导肝病的发生,但ESR1基因启动子的异常甲基化在ACHBLF患者中所起的作用还未有研究。研究目的通过检测对比健康人(Healthy controls,HC)、CHB、肝衰竭前期及ACHBLF早期、中期、晚期三期患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中ESR1基因启动子的甲基化状态,分析ESR1启动子的甲基化从HC、CHB、肝衰竭前期至肝衰竭时的动态变化并与ACHBLF患者的病情相结合,初步探讨PBMC-ESR1启动子的甲基化作为无创性的指标早期预测ACHBLF患者短期28天生存状态的可行性。研究方法研究对象为2009年9月到2016年1月间在山东大学齐鲁医院肝病科接受治疗的131例ACHBLF患者,随机选取同一时间段的73例CHB患者和40例HC作为对照组。131例ACHBLF患者中,113人在入院时已被诊断为ACHBLF(包括早期患者67例,中期29例,晚期17例),另外18人在住院期间从肝衰竭前期逐步进展至ACHBLF,作为动态观察组。所有的ACHBLF患者追踪随访28天。甲基化特异性PCR方法检测HC组、CHB、肝衰竭前期和ACHBLF患者PBMC-ES1基因启动子甲基化率,实时定量PCR技术检测ESR1 mRNA的表达。卡方检验分析不同组ESR1甲基化率的比较,Cox比例风险模型分析影响ACHBLF患者生存的危险因素,Kaplan-Meier方法计算生存曲线,ROC曲线判断PBMC-ESR1启动子的甲基化早期判断ACHBLF患者预后的合理性。研究结果1.ACHBLF组和CHB组在进行HBeAg、HBeAb、HBV-DNA比较时无明显的统计学差异;ACHBLF组、CHB组、HC组三组间比较时,年龄、性别、肌酐均没有统计学差异,而显示肝衰竭严重程度的总胆红素、白蛋白、凝血酶原活动度、国际标准化比率存在统计学差异(P<0.001);ACHBLF组中腹水、肝性脑病、自发性细菌性腹膜炎的发生率分别为66.37%、30.97%和27.43%,死亡率为67.26%。ACHBLF患者生存组的总胆红素(P=0.003)、肝性脑病的发生率(P=0.001)、MELD值(P<0.001)明显低于非生存组,其他临床指标均没有显著的统计学差异。2.ACHBLF患者PBMC-ESR1基因启动子的甲基化率(66.37%)明显高于CHB组(21.92%,P<0.001)和HC组(11.54%,P<0.001),但CHB组和HC组间无统计学差异;ACHBLF非生存组PBMC-ESR1基因启动子的甲基化率显著高于生存组(77.63%vs 29.73%,P<0.001);ACHBLF患者甲基化组ESR1 mRNA的表达量明显低于非甲基化组(P<0.001)。3.ACHBLF患者PBMC-ESR1启动子甲基化组的白蛋白水平显著低于非甲基化组(P= 0.027),MELD值则高于非甲基化组(P= 0.044),其他临床指标均没有统计学差异。4.从肝衰竭前期进展至ACHBLF的动态观察中,ESR1启动子的甲基化率随病情的严重程度变化,病情越危急,甲基化率越高。5.Cox比例风险模型提示MELD值、肝性脑病、ESR1启动子的甲基化有可能是预测ACHBLF患者28天死亡率的独立危险因素。6.PBMC-ESR 基因启动子的甲基化预测ACHBLF早期患者28天生存状态的诊断价值明显高于MELD评分>24.6(P = 0.015)。结论PBMC-ESR1基因启动子的甲基化与ACHBLF患者的病情严重程度相关,可能是预测早期ACHBLF患者短期28天生存状态的无创性生物学指标。第二部分:血清ESR1、DNMT3b、CDH1基因的甲基化早期诊断HBV相关肝癌的研究研究背景:肝细胞癌(简称肝癌)在我国恶性肿瘤相关性死亡中排名第二位,严重影响国民健康。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是肝癌发生的重要危险因素之一,HBV感染相关的肝癌又称为HBV相关肝癌(HBV-related hepatocellular carcinoma,HBV-related HCC)。尽管肝癌的综合治疗发展迅速,但5年生存率仅为30%-40%,而HBV-related HCC预后更差,不到12%。理想的治疗效果取决于疾病的早期诊断和合理治疗。血清甲胎蛋白和影像学检查是目前诊断肝癌的主要检测手段,但是甲胎蛋白诊断肝癌时假阳性和假阴性较高,影像学检查在肿瘤体积较小时存在漏诊。因此寻求一种新的肿瘤标志物能够从慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)和 HBV相关肝硬化(HBV-related Liver cirrhosis,HBV-related LC)患者中早期筛查HBV-related HCC是临床亟待解决的问题。基因启动子的异常甲基化被广泛用作肿瘤发生、复发、转移和对化疗药物敏感性的生物学标志物。HBV基因组编码的HBx蛋白通过上调DNA甲基转移酶,引起基因启动子的高甲基化,表达下调,扰乱细胞正常的生长、增殖、分化、凋亡程序,最终导致HBV-related HCC的发生。HBV-related HCC患者中男性占绝大多数,说明雌激素信号通路可能具有抑制肝癌发生的作用。而雌激素只有与雌激素受体(Estrogen Receptor，ESR)(肝脏中以ESR1为主)结合后才能发挥抗氧化、抗肝纤维化、抗癌等生物学效应,ESR1基因组学的变异可能促进HBV-related HCC的发生。DNA甲基化转移酶3b(DNA methyltransferases 3b.DNT3b)是催化基因新生甲基化的关键酶。CDH1基因编码的钙粘附蛋白E,介导基底膜同种细胞间的连接,钙粘附蛋白 E表达减少,细胞间粘附力降低,肿瘤细胞的侵袭、转移能力增强。既往研究发现乳腺癌、结肠癌和胃癌中存在不同程度的ESR1、DNET3b和CDH1基因启动子的异常甲基化,但是目前并没有ESR1、DNMT3b和CDH1基因启动子甲基化的联合检测作为HBV-related HCC早期诊断的血清学标志物的文献报道。研究目的通过检测对比HBV-related HCC、HBV-related LC、CHB和健康人(Normal control,NC)血清中ESR1、DNMT3b和CDH1基因启动子的甲基化率,分析HBV-related HCC进展过程中不同基因的异常甲基化与病例资料的相关性,探讨血清基因启动子甲基化的联合检测用于早期诊断HBV-relatedHCC的可行性。研究方法研究选取2011年1月至2013年5月在山东大学齐鲁医院治疗的183例肝癌患者作为实验组,包括153例HBV-related HCC患者和30例非HBV相关肝癌患者(Non-HBV-related HCC),随机选取同一时间段的47例HBV相关肝硬化和126例CHB、50例NC作为对照组。甲基化特异性PCR方法分析不同人群血清ESSR1、DNMT3b和CDH1基因启动子的甲基化率。卡方检验或Fisher精确检验用于不同组不同基因启动子甲基化率的比较,ROC曲线分析二个基因甲基化的联合检测早期诊断HBV相关肝癌的合理性。研究结果1.HBV-related HCC 患者血清中ESR1(30.07%)、DNMT3b(41.18%)和CDH1(27.45%)的甲基化率显著高于HBV-related LC患者(P<0.001,P<0.001,P =0.007)、CHB患者(P<0.001,,P<0.001,,P<0.001)和NC组(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。但是,三个基因启动子的甲基化率在NC和CHB、NC和HBV-related LC、CHB和HBV-related LC之间差异均没有统计学意义。2.Non-HBV-related HCC患者CDH1基因启动子的甲基化率(46.67%)显著高于HBV相关肝癌患者(27.45%,P = 0.037),而DNMT3b(P=0.905)和ESR1(P = 0.709)的甲基化率在两者之间均没有显著性差异。3.HBV-related HCC患者合并肝硬化时ESR1基因启动子的甲基化率显著高于未合并肝硬化者(= 0.005),手手术切除组ESR1的甲基化率明显高于采取其他治疗措施组(P= 0.027);DNMT3b的甲基化率在肿瘤直径大于10厘米的患者中高于3-10厘米患者(P=0.028),单个结节的甲基化率显著高于多个结节者(P =0.045);男性CDH1的甲基化率明显高于女性(P = 0.026)。而三个基因启动子的甲基化均与甲胎蛋白白、e抗原、肿瘤细胞的分化程度、大血管侵犯、肝内微小转移灶无关。4.Non-HBV-related HCC患者血清中ESR1甲基化率在AFP ≥ 400 ng/mL组显著高于AFP<400 ng/mL组(P=0.048);DNM 3 的甲基化率在肿瘤直径小于3厘米的患者中高于3-10厘米患者(P= 0.010);CDH1启动子的甲基化率与性别、年龄、肿瘤直径、结节数目、e抗原、甲胎蛋白、合并肝硬化、肿瘤细胞的分化程度、大血管侵犯、肝内微小转移灶、治疗方式等均没有相关性。5.两个基因同时发生甲基化的组合中,血清CDH1和ESR1同时发生甲基化的概率在HBV-related HCC患者中为21.62%,而在Non-HBV-related HCC患者中这一组合发生的概率为0。6.从CHB患者中辨别HBV-related HCC时,甲基化联合检测的敏感性是84.48%,特异性66.26%,阳性预测值2.50,阴性预测值0.23,曲线下的面积(The area under ROC curves,AUC)显著高于甲胎蛋白(P=0.003);从HBV-related LC患者中诊断HBV-related HCC时,甲基化联合检测的AUC明显高于血清甲胎蛋白(P= 0.045)。结论1.HBV-related HCC患者血清中较常出现ESR1、DNMT3bCDH1基因启动子的异常高甲基化,血清甲基化的联合检测可能是早期诊断HBV-related HCC的标记物。2.HBV-related HCC和Non-HBV-related HCC相同基因启动子的甲基化率不同,不同基因联合检测的甲基化率也不同,提示HBV影响肝癌的表观遗传学修饰。