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已知硝酸盐运输基因(Nitrate transporter)OsNRT2.3有两个蛋白产物,OsNRT2.3a和OsNRT2.3b。其中过量表达OsNRT2.3b可以调高水稻产量和氮素利用效率,但过量表达OsNRT2.3a却没有相同效果。为了探索这两个蛋白在水稻中作用机制差异,我们利用了原核蛋白表达系统、原生质体瞬时表达系统,结合荧光显微镜检测、酶标仪检测、流式细胞仪检测等实验方法对这两个蛋白的跨膜结构进行了初步分析,得到如下实验结果:1)OsNR2.3a/b原始基因截断片段融合报告基因GFP、PhoA诱导表达后,荧光显微镜下观察,OsNRT2.3a的N134-GFP、N199-GFP均无荧光信号;OsNRT2.3b的N104-GEP、N169-GFP 也均无荧光信号。OsNRT2.3a 的 N134-PhaA、N199-PhoA 均无酶活性;OsNRT2.3b的N104-PhoA、N169-PhoA也均无酶活。这可能是由于四段基因在细胞膜内外均无表达,因此应当将密码子优化后再表达。2)将OsNRT2.3a/b的基因原核优化后的蛋白表达显示,OsNRT2.3a-N-GFP、OsNRT2.3b-N-GFP 均检测到绿色变荧光 OsNRT2.3a-N-PhoA、OsNRT2.3b-N-PhoA 都没有检测到酶活性。这一方面说明密码子原核优化能提高目的基因的表达效率;另一方面也验证了 OsNRT2.3a/b的N端是位于细胞膜内的。而OsNRT2.3a/b中间位点及C端的融合蛋白的表达结果显示,这两者之间的报告信号没有差异,与跨膜结构预测不符。推测是由于异源表达系统表达融合蛋白无法使其正确跨膜,因此我们决定将此基因置于水稻原生质体中表达。3)OsNRT2.3a/b全长基因序列C端及中间特定研究位点插入His蛋白标签6×His-tag(His-His-His-His-His-His)后在水稻原生质体中表达。流式细胞仪检测后发现:OsNRT2.3a((201His)未处理前即有较高FI值(Fluorence index,GFP阳性率FI = 检测到GFP荧光信号的原生质体数/过柱的全部原生质体数),处理后FI值未显著升高,与膜外位点阳性对照情况相同,所以,此处应位于细胞膜外;OsNRT2.3b(171His)未处理前FI值较低,处理后FI值显著升高,所以,此处应位于细胞膜内;OsNRT2.3a的C端融合蛋白表达后,与阴性对照情况相同,位于细胞膜内;OsNRT2.3b-C处理前后FI值均较高,位于细胞膜外。信号结果均符合跨膜结构的预测模型。综上所述,本实验采用目的基因融合报告基因,蛋白表达后检测报告基因信号来检测特定位点位于细胞膜内外的情况。OsNRT2.3a/b的初步检测结果与预测跨膜结构相符,证明OsNRT2.3a/b跨膜结构差异较大,此种蛋白结构的差异极有可能导致两种蛋白功能的差异,并可能最终影响水稻的田间产量。我们的实验也为OsNRT2.3b中pH位点的研究提供了结构证据,从而证明OsNRT2.3b在调节水稻细胞内的pH稳态方面意义重大。