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研究背景和目的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)在肺癌中约占80%-85%[1],是死亡率最高的肿瘤之一[2]。放疗是NSCLC的主要治疗方法之一,不仅用于各个分期的NSCLC[3,4],也成为EGFR-TKIs获得性耐药局部进展或中枢神经系统转移的治疗选择之一[5-7]。但遗憾的是,目前临床上缺乏放疗敏感性预测因子。不管是临床回顾性研究还是基础研究均显示,EGFR基因突变的NSCLC相对于EGFR野生型细胞对放射线敏感[8-15]。我们的一项前期临床回顾性分析也显示,EGFR突变型脑转移NSCLC患者放疗有效率更高[16,17],提示EGFR基因突变可能是潜在的特异性放疗敏感性预测因子。但是,最近一项研究显示EGFR突变状态与NSCLC放射敏感性无相关性[18],提示EGFR基因突变与NSCLC放射敏感性的相关性尚需要进一步研究证实。对于EGFR-TKIs获得性耐药后局部进展或者中枢神经系统转移的患者,包括放疗在内的局部治疗措施也是主要选择之一。临床研究中,EGFR-TKIs治疗后局部进展或者中枢神经系统转移的患者在放疗后继续使用TKIs可以获得较长的PFS以及OS[5,19,20]。既往研究发现EGFR-TKIs获得性耐药细胞株在放射线照射后都出现对gefitinib敏感性增高[21-24],并且发生间质上皮转换(Mesenchymal Epithelial Transition,MET)[25],但是其具体机制目前尚未明确。基于以上研究背景,我们拟对7株EGFR基因突变状态不同的NSCLC细胞和2株EGFR-TKIs获得性耐药NSCLC细胞株进行放射敏感性检测,并对其可能的机制进行研究。另外,初步研究了放射线对EGFR-TKIs获得性耐药细胞的药物敏感性的作用及其可能的机制。本研究在既往研究背景以及前期临床回顾性研究基础上,寻找新的高特异性放疗敏感性预测因子,优化NSCLC患者个体化治疗方案,对提高NSCLC患者治疗有效率,延长NSCLC患者生存具有重要意义。方法1、EGFR基因突变与NSCLC放射敏感性的相关性:我们选用EGFR野生型肺鳞癌细胞H226、腺癌细胞A549、大细胞肺癌细胞H460,EGFR 19外显子缺失突变型NSCLC细胞PC-9、HCC827,EGFR 21外显子L858R突变型NSCLC细胞H1975、H3255,EGFR-TKIs获得性耐药细胞株PC-9/AB、PC-9/ZD。通过克隆成型实验检测各细胞株的放射敏感性,并拟合单击多靶模型和线性平方和模型,得出各细胞株的放射生物学参数。2、EGFR基因突变对放射线敏感可能的机制:绘制生长曲线检测各株细胞在放射线照射后群体增殖能力,流式细胞术检测各株细胞在放射线照射后细胞周期分布及凋亡情况,免疫荧光法检测各细胞株在放射线照射后DNA双链断裂(DNA double stranded breaks,DSBs)形成情况,western-blot实验检测各细胞株放射线照射后凋亡蛋白,抗凋亡蛋白及修复蛋白表达情况。3、研究放射线对EGFR-TKIs获得性耐药细胞gefitinib药物敏感性作用及可能的机制:通过对EGFR-TKIs获得性耐药细胞PC-9/AB和PC-9/ZD进行4次剂量为6Gy的放射线照射后培育放射线照射细胞株PC-9/AB IR、PC-9/ZD IR。采用CCK8法检测各细胞对gefitinib药物敏感性,NGS(next-generation sequencing)法检测放射线照射后基因突变、扩增情况,western-blot实验检测各株细胞E-cadherin、vimentin蛋白表达情况。4、统计学方法:应用IBM SPSS Statistics 20.0进行统计学分析,各实验重复3次,数据以均数±标准差表示,组间比较采用T检验,P﹤0.05时认为差异具有统计学意义。结果1、EGFR基因突变的NSCLC细胞对放射线敏感与EGFR野生型NSCLC细胞A549、H226对比,EGFR突变型细胞PC-9、HCC827、H1975、H3255和EGFR-TKIs继发性耐药细胞PC-9/AB、PC-9/ZD对放射线敏感,且EGFR突变型细胞与EGFR-TKIs继发性耐药细胞放射敏感性无明显差异。EGFR野生型NSCLC细胞H460对比EGFR野生型NSCLC细胞A549、H226对放射线敏感,与EGFR突变型细胞、EGFR-TKIs继发性耐药细胞放射敏感性相近。放射生物学参数显示,在代表37%杀伤的D0值和代表准阈杀伤的Dq值中,A549和H226细胞的D0值和Dq值明显高于其他细胞。在代表修复能力的α/β值中,A549、H226、HCC827细胞明显低于其他细胞,提示A549、H226、HCC827细胞的放射线照射后修复能力较其他细胞强。2、EGFR基因突变NSCLC细胞放射敏感性高的初步机制生长曲线显示,EGFR突变型细胞在放射线照射后群体增殖能力低于H226细胞和A549细胞。流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡情况显示,A549和H226细胞在放射线照射后没有出现凋亡,其他细胞在放射线照射后24小时出现明显凋亡。A549和H226细胞在放射线照射后出现细胞周期G0/G1、G2/M期增多,并持续增加至放射线照射后48小时,而其他细胞在放射线照射后仅出现G2/M期的增加,没有出现G0/G1期的增加,且G2/M期增加在放射线照射后24小时达到峰值并开始下降。免疫荧光实验显示,A549和H226细胞放射线照射后照30min才出现明显的γ-H2AX焦点形成,并在放射线照射6小时后γ-H2AX焦点形成消失。而其他细胞在放射线照射后15min就可出现明显的γ-H2AX焦点形成,并持续到放射线照射后24小时。Western-blot实验显示,EGFR突变型细胞放射线照射后促凋亡蛋白Bax、凋亡蛋白Caspase-3表达,抗凋亡蛋白Bcl-2、修复蛋白DNA-PKcs不表达或表达减少。A549和H226细胞在放射线照射后表达Bcl-2、Caspase-3,不表达促Bax,DNA-PKcs表达至少持续至放射线照射后6h。H460细胞在放射线照射后Bax、Bcl-2、Caspase-3、DNA-PKcs均出现表达。3、放射线逆转PC-9/AB、PC-9/ZD细胞对gefitinib获得性耐药及初步机制PC-9/AB IR和PC-9/ZD IR细胞形态发生改变,表现为细胞呈圆形,并且体积变小。CCK8法显示PC-9/AB IR、PC-9/ZD IR细胞相对PC-9/AB、PC-9/ZD细胞,对gefitinib药物敏感性恢复。NGS检测并未发现放射线照射后出现基因突变、扩增或者融合,仅PC-9/ZD细胞在放射线照射后出现AKT1基因11外显子F349L突变消失。Western-blot实验显示,PC-9/AB IR、PC-9/ZD IR细胞对比PC-9/AB、PC-9/ZD细胞E-cadherin表达增多、Vimenten表达降低,发生MET。结论EGFR突变与NSCLC放射敏感性相关,修复能力下降、细胞周期分布、细胞增殖能力下降、更容易发生放射线引起的损伤是EGFR突变的细胞放射敏感性高可能的机制。EGFR-TKIs获得性耐药细胞未见到明显的放射敏感性改变。放射线可以逆转EGFR-TKIs获得性耐药细胞对gefitinib耐药性,其机制可能是放射线照射后发生MET。