家蚕HN1L蛋白在杆状病毒侵染过程中调控机制的研究

来源 :浙江理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhangjianmei88
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家蚕是一种鳞翅目模式昆虫,杆状病毒是专一性侵染鳞翅目昆虫的病毒,家蚕与杆状病毒之间相互作用的研究具有多方面的应用价值,二者之间相互作用机制的阐明对害虫的生物控制、外源蛋白的真核表达以及宿主对病毒免疫抗性机制的揭示等方面都具有十分重要的意义。  血液-神经表达蛋白1样蛋白(hematalogical and neurological expressed1protein-like,hn1l)广泛表达于多种动物组织中,该蛋白被抑制表达后会出现细胞周期阻滞现象,是一种重要的功能蛋白,但其在家蚕细胞中的生物学功能尚未可知。前期的杆状病毒感染前后的家蚕细胞蛋白质表达差异组学分析结果显示,家蚕HN1L蛋白在病毒侵染的家蚕细胞中表达水平显著下调。为了深入了解该蛋白的生物学功能,主要研究了以下内容:①通过对HN1L蛋白序列(基因序列号)进行生物学信息分析,发现家蚕HN1L与人类和小鼠同源性达到59%,并具有相同的保守结构域。因此,推测家蚕HN1L蛋白可能也具有相似的生物学功能;②构建重组原核表达载体pET32a-hn1l并在大肠杆菌中进行表达、纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,用于后续研究;③构建了重组瞬时表达载体pIEX-1-hn1l用于在家蚕细胞中过表达目的蛋白,Western blot检测发现重组质粒在转染BmN细胞36h后hn1l开始表达水平,48h后达到峰值,之后趋于稳定,由此确定了最佳表达时间为48h;④细胞活力检测发现HN1L蛋白过表达可以显著增强细胞活力(p<0.01),促进细胞增殖;⑤DNA片段化检测结果表明,HN1L蛋白表达上调对DNA片段化水平有一定程度的抑制作用(p<0.05)。此外,Western bolt检测结果也显示,与正常细胞相比,HN1L蛋白的过表达对于病毒感染诱导的caspase-9酶原活化和Bax表达水平上调均显著下降,而Bcl-2的表达水平增加。流式细胞术检测结果也进一步证实,过表达HN1L可显著抑制BmNPV感染诱导的细胞凋亡。因此,推测HN1L对细胞凋亡也具有一定的抑制作用;⑥检测HN1L蛋白过表达对细胞周期的影响,Western blot检测结果显示HN1L过表达的细胞中周期蛋白Cyclin D较正常细胞减少,同时流式细胞术检测结果也表明G1期细胞减少而S期细胞增加(p<0.05),说明家蚕HN1L蛋白对细胞的G1/S期转换有一定的促进作用;⑦通过荧光定量PCR技术检测了病毒在过表达HN1L蛋白的BmN细胞中的复制能力,结果显示病毒的复制能力显著低于正常BmN细胞(p<0.05),说明HN1L蛋白对杆状病毒的复制具有一定的抑制作用。综上所述,可知家蚕HN1L蛋白具有增强细胞活性、促进细胞增殖、抑制病毒感染诱导的细胞凋亡、促进细胞G1/S期的转换、抑制病毒复制等多种生物学活性,是一种家蚕重要的功能蛋白。
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