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芽胞杆菌(Bacillus)细胞表面展示系统是一种具有热稳定性的、可用于多种外源蛋白展示的生物技术平台。苏云金芽胞杆菌(B. thuringiensis)在芽胞杆菌属是仅次于模式种枯草芽胞杆菌(B. subtilis)的重要细菌种。该菌突出的特征是在形成芽胞的同时,能产生具有杀虫活性的伴胞晶体,目前已发展成重要的的杀虫细菌,同时也在表面展示多功能活性系统的应用方而展现出良好的应用潜力,成为发展细菌表面展示系统的优良宿主菌而在国内外受到重视。本研究利用一种芽胞杆菌细胞壁锚定蛋白作为运载蛋白,发展了一种从体内连续性展示于苏云金芽胞杆菌营养细胞和芽胞、体外展示于多种芽胞杆菌的营养细胞和芽胞的多重活性展示系统,并分别以绿色荧光蛋白和一种细菌突变漆酶作为目标蛋白进行了展示活性分析。这一多重活性的细菌表面展示系统目前在国内外尚未见报道。苏云金芽胞杆菌m坛是从野生菌株YBT-1520基因组中分析推定的,编码一种具有较强的细胞壁锚定结合性能的自溶素。本研究首先利用RT-PCR技术测定了该蛋白编码基因mbg在野生菌株中经连续7天培养周期中的相对转录活性量,结果显示mbg基因转录在菌体培养至约80%芽胞裂解时达到最高的活性值。通过对Mbg蛋白结构的预测,推断其是一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,其C端为催化结构域,N端是含有两个LysM的锚定结构域。为探索白溶素Mbg的N端结构域(Mbgn)作为表面展示体系中运载蛋白的活性,本研究通过将分别扩增得到的3个基因片段Pcry3Aa-mbgn-gfp连接到质粒载体pHT304上得到可在营养期起始表达融合蛋白Mbgn-GFP的重组质粒pMB164。经转化苏云金芽胞杆菌BMB171,筛选得到重组菌MB164。对重组菌MB164细胞的GFP特异荧光活性测定、免疫荧光显微镜观测和流式细胞仪分析测定结果表明,体内表达Mbgn-GFP融合蛋白不仅被高水平地锚定于营养细胞的表面,而且外源蛋白(GFP)是以其活性形式而展示于细胞表面。对重组菌MB164生长周期中各时期的GFP特异荧光活性进行了定时取样监测,结果表明在96h后(经显微镜观测,此时约70%芽胞被释放),MB164的总荧光活性发生约33%的增加,而对照的MB165总荧光活性值发生约34%的减少,说明由Mbgn锚定的GFP可被展示于芽胞的表面。为了进一步验证和分析,构建融合蛋白的表达纯化载体pMB313,融合基因mbgn-gfp连接到pET22b(+)载体上。用纯化的融合蛋白Mbgn-GFP对细胞和芽胞进行体外的锚定实验,苏云金芽胞杆菌的营养体细胞荧光强度位能达到180,而其芽胞和枯草芽胞杆菌的营养体、芽胞都能达到140,并且这种体外锚定性能还在其它种类的革兰氏阳性菌中实现,证明了Mbgn锚定功能的广泛性。随后,用漆酶蛋白WlacD作为功能蛋白替代报告蛋白GFP构建了Mbgn-WlacD表面展示体系重组质粒命名为pMB316,转化苏云金芽胞杆菌得到重组菌MB316。对重组菌细胞的漆酶活性进行测定,MB316营养体酶活性可达10.56 U/ml远高于对照菌株BMB171(1.148 U/ml),芽胞(4.648 U/ml)也具有一定活性。随后免疫荧光显微镜观测和流式细胞仪分析测定(Cy5荧光效率为33.43%)结果表明,体内表达Mbgn-WlacD融合蛋白不仅被高水平地锚定于营养细胞的表面,而且WlacD以其活性形式而展示于细胞表面同样使用纯化的融合蛋白对细胞和芽胞进行体外锚定,构建Mbgn-WlacD融合蛋白纯化载体,融合基因mbgn-wlacD连接至pTrcHisC,命名为pMB317。经Mbgn-WlacD纯化蛋白孵育的苏云金芽胞杆菌营养体酶活为2.74 U/ml(未孵育的仅为1.15 U/ml)、芽胞酶活性为1.86 U/ml(未孵育的为0.744 U/ml),枯草芽胞杆菌的营养体(2.22 U/ml)和芽胞(1.72 U/ml)表面也检测到漆酶活性,再次证实了Mbgn作为运载蛋白具有的锚定功能的广泛性。