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目的：1.构建重组逆转录病毒载体MIGR1-ICAM-1,探讨细胞间粘附分子1(Intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)基因转染对小鼠间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)生物学特性的影响。为进一步研究ICAM-1是否影响MSCs对自身免疫性甲状腺炎(Autoimmune Thyroiditis, AIT)体内治疗效果提供实验基础。2.利用外源性甲状腺球蛋白免疫C57BL/6小鼠建立AIT的动物模型——实验性自身免疫性甲状腺炎(Experimental Autoimmune Thyroiditis, EAT),为下一步开展大规模体内实验提供稳定可靠的动物模型。方法：1.通过RT-PCR方法扩增获得小鼠脾细胞ICAM-1基因全长DNA,将其克隆至中间载体pMD19-T,行双酶切及DNA测序鉴定后,将ICAM-1基因连接至逆转录病毒载体MIGR1七,对重组载体MIGR1-ICAM-1进行双酶切、RT-PCR及DNA测序分析。2.将获得的重组逆转录病毒质粒MIGR1-ICAM-1及空质粒MIGR1均加入包装质粒ECOS后分别转染人胚肾细胞(T293细胞),将获得携带ICAM-1基因的逆转录病毒MIGR1-ICAM-1及空载体逆转录病毒MIGR1,分别感染C3H10T1/2细胞,荧光倒置显微镜下观察荧光蛋白的表达, real-time PCR和流式细胞术检测ICAM-1在基因水平和蛋白水平的表达。同时检测三种细胞的形态、表型、生长特点及成脂成骨分化等一般生物学特性；并通过淋巴母细胞转化实验(Lymphocyte transformation test, LTT)及混合淋巴细胞反应实验(Mixed lymphocyte reaction, MLR)检测三种细胞的免疫学特性。3.建立EAT动物模型,将5周龄雌性C57BL/6小鼠于第0d和第14d用猪甲状腺免疫球蛋白(Porcine Thyroglobuli, PTg)及弗氏佐剂(Freund’s adjuvant, FA)进行两次免疫；于实验第28d眼球取血,测血清甲状腺球蛋白抗体(Thyroglobulin Antibody, TgAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(Antithyroid Peroxidase Antibodies,TPOAb)、甲状腺微粒体抗体(Thyroid microsomal Autoantibody, TMAb)水平,并分离甲状腺组织行HE染色及组织病分析。结果：1.对重组载体MIGR1-ICAM-1双酶切和RT-PCR电泳均显示获得1700bpICAM-1目的基因片段；DNA测序结果显示与基因文库中的小鼠ICAM-1基因序列完全相同,且插入方向正确,从而证实成功构建重组逆转录病毒载体MIGR1-ICAM-1。2.逆转录病毒感染C3H10T1/2细胞后,荧光倒置显微镜下可见绝大部分细胞表达绿色荧光；real-time PCR和流式细胞术分别在转录水平(相对表达量1625.82+119.42)和蛋白水平(表达量90.3%)证实ICAM-1在C3H10T1/2细胞中均有高表达,从而证明获得稳定过表达ICAM-1的间充质干细胞系C3H10T1/2(C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC)。3.进一步对过表达ICAM-1的C3H10T1/2细胞的生长特性、诱导分化能力及免疫学功能进行研究,结果表明,过表达ICAM-1可使C3H10T1/2细胞(29.18±2.47)%处于S期,且倍增时间缩短。在成脂诱导分化中,C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC获得脂肪细胞数显著降低(12.18±3.83/孔),且脂滴变小；real-time PCR检测成脂分化关键转录因子C/EBPα和PPARy的表达均显著下调；同样,在成骨分化中,过表达ICAM-1可使C3H10T1/2成骨分化的碱性磷酸酶活性及矿化骨结节形成能力显著下降,关键转录因子Runx2和Osteocalcin在mRNA表达水平亦显著降低,提示过表达ICAM-1可显著降低MSCs的成脂和成骨分化能力。4.利用淋巴母细胞转化实验(Lymphocyte transformation test, LTT)和混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction, MLR)对过表达ICAM-1的MSCs进行免疫功能检测,结果显示,在LTT体系中,当MSCs:T细胞分别为1：40和1：5时,C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC与对照组C3H10T1/2-MIGR1/MSC的cpm值分别为(1955.25±292.60)、(2285.33±303.67)；(812.00±21.17)、(1335.00±209.18)；同样,在MSCs作为滋养层的MLR反应体系中,当刺激细胞：效应细胞为1：1和1：25时,C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC与对照组C3H10T1/2-MIGR1/MSC的cpm值分别为(1598.50±110.74)、(1859.00±111.25)；(1147.50±55.91)、(1493.00±98.33)。提示过表达ICAM-1的MSCs具有显著抑制T细胞增殖的能力,且具有剂量依赖性,随着MSCs数量的增加,其抑制能力逐渐增强。5.C57BL/6小鼠经外源性甲状腺球蛋白皮下免疫诱导后,结果显示,模型组小鼠血清中TPOAb、TMAb、TgAb的水平[(60.36±4.53)、(67.47±6.25)、(65.67±5.35)]均显著高于对照组小鼠[(21.45±4.66)、(7.68±2.76)、(7.59±2.23)]；甲状腺病理显示滤泡间质存在淋巴细胞浸润情况,具有典型EAT特征。结论：1.本研究通过构建ICAM-1的重组逆转录病毒载体MIGR1-ICAM-1,成功获得稳定过表达ICAM-1的间充质干细胞系C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC。2.对过表达ICAM-1的MSCs生物学特性研究表明,过表达ICAM-1可使MSCs增殖能力增强、成脂成骨分化能力减弱；最为关键的是,过表达ICAM-1可显著增强MSCs的免疫抑制作用,为进一步研究ICAM-1是否影响MSCs对AIT体内治疗效果提供实验基础。3.同时本研究利用外源性甲状腺自身抗原免疫方法成功建立EAT,从而证实该实验方法建模成功率高、可行性强并且可重复性高。为下一步的体内实验提供了稳定可靠的动物模型。