一些重金属虽然是植物必需的微量元素,过量也会对植物产生毒性,严重影响植物正常的生长代谢,但是一些金属型植物由于长期生长在富含重金属的土壤中,对高浓度的重金属产生了耐受性。海州香薷(ElsholtziahaichowensisSun)是著名的国产Cu矿区金属型植物,其铜抗性(MP)和非抗性种群(NMP)均被发现分布于长江中下游地区。已有很多研究致力于揭示海州香薷铜抗性种群的抗性机制。前期研究结果表明,酸性转化酶(包括液泡转化酶和细胞壁转化酶)对金属型植物的根部生长以及根/芽生物量的分配起到至关重要的作用,因而可以通过碳源和能量配给参与金属型植物的铜抗性机制。铜胁迫下,海州香薷铜抗性种群根中酸性转化酶的活性以及相应酸性转化酶基因的转录水平明显高于非抗性种群,而基因异源表达研究表明两个种群酸性转化酶氨基酸序列的差别并未导致相应酶的特性有显著性差异。因此,海州香薷两个种群酸性转化酶基因的蛋白编码区序列的差别与Cu胁迫下相应酶活性和基因转录水平差异没有直接关系,一些其他机制,如基因启动子表观遗传修饰可能参与其中。表观遗传修饰可以在不改变DNA序列的情况下调控基因的表达,其中DNA甲基化作为重要的表观遗传修饰之一,对基因的表达调控起着重要作用。重金属胁迫可以影响基因组以及特定区域的DNA甲基化水平。目前关于重金属胁迫对植物甲基化影响的研究大多都是基于甲基敏感型内切酶的检测方法,并不能精确检测到每一个胞嘧啶的甲基化状态,因而主要集中在重金属胁迫后对植物整体DNA甲基化水平的影响上,鲜有深入到相关基因甲基化变化的研究。鉴于亚硫酸氢盐测序技术(BS-Seq)可以在单碱基分辨率水平检测基因的甲基化状态,本研究工作采用该方法检测Cu胁迫下海州香薷Cu抗性和非抗性种群酸性转化酶基因启动子甲基化水平和模式是否存在差异,以期从表观遗传修饰的角度探讨Cu胁迫对相应基因表达调控的可能影响。主要研究结果如下:(1)海州香薷液泡转化酶基因(vINV)启动子主要在CG位点产生甲基化,CHG和CHH位点也有甲基化的发生,但是概率很低且处于低甲基化状态。无论是非胁迫还是铜胁迫条件下,海州香薷两个不同抗性种群之间在CG,CHG和CHH位点处的总甲基化水平都没有明显的差异,且Cu胁迫也未导致海州香薷抗性或者非抗性种群在三种不同类型胞嘧啶位点的甲基化水平发生较大变化。海州香薷vINV启动子包含18个CG位点,21个CHG位点和217个CHH位点。在18个CG位点中,有15个处于超甲基化状态,且位于CG位点富集区(-1315到-1019 bp),而其他3个远离这个区段的CG位点几乎都处于低甲基化状态。一个特殊的CHG位点(-1061 bp)的甲基化状态在铜胁迫下的变化于两个不同抗性种群之间表现出很大的差异,可能参与液泡转化酶的差异表达。(2)海州香薷两个不同抗性种群之间细胞壁转化酶基因(cwINV)启动子整体甲基化水平也没有明显的差异。铜胁迫下,除了非抗性种群的CHH位点甲基化水平几乎不变之外,两种群三种不同类型位点的甲基化水平均略有下降。海州香薷cwINV启动子包含25个CG位点,45个CHG位点和222个CHH位点,所有的CG位点以及大多数CHG和CHH位点都处于低甲基化状态。铜胁迫下,cwINV启动子区域-1478,-1447,-1256,-1181,-1068,-842 bp处CHH位点甲基化状态的变化在两个不同抗性种群之间表现出巨大差异。其中-1478 bp和-1265 bp处的CHH位点分别在5UTR Py-rich stretch和Skn-1_motif 上,而-1447 bp 和-1068 bp 处的 CHH 位点则分别在 CARE-motif 和TATC-box上游和下游2bp的位置。这些位于预测的顺式作用元件上的甲基化差异位点可能参与Cu胁迫下细胞壁转化酶基因的表达调控。(3)铜胁迫并未导致海州香薷vINV和cwINV启动子在CG位点处的甲基化发生变化或者在两个不同抗性种群之间有明显差异,因此CG位点的甲基化相对保守,但是一些特殊的CHG和CHH位点的甲基化响应铜胁迫并表现出种群特异性,说明CHG和CHH位点甲基化状态比CG位点甲基化更容易受到逆境胁迫的影响。海州香薷不同抗性种群酸性转化酶基因(包括液泡和细胞壁转化酶基因)启动子上的甲基化差异位点,其甲基化水平在抗性种群中保持相对稳定,而在非抗性种群中受铜诱导大幅上升或下降。