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酪氨酸酶是一种不需要辅酶的氧化还原酶,能够将一元酚氧化成邻位的二元酚并进一步氧化生成邻苯醌,具有潜在工业应用价值。酶交联聚集体(CLEA)是一种集纯化与固定化为一体的新型无载体固定化酶技术,它具有操作简单、成本低廉、无需纯化的酶,固定化的酶稳定性强等优点,已成功地应用于多种酶的固定化。低共熔溶剂(DES)是新一代绿色反应介质,作为助溶剂能够有效地提升酶的活性和稳定性,而将其引入到固定化酶的制备过程中尚未见报道。本文首次将DES和CLEA相结合,在酪氨酸酶的交联聚集体的制备过程中引入DES,对制备条件进行筛选,探究其对CLEA的活性和稳定性影响,并应用到化合物3,4-二羟基苯乙酸、白皮杉醇、3’-羟基紫檀茋的合成。本文的研究主要包括以下内容:1.DES-CLEA的制备及其催化性质研究由两种胆碱盐(氯化胆碱和醋酸胆碱)和4种氢键供体(尿素、乙酰胺、甘油、乙二醇)按3个摩尔比(1:2,1:1,2:1)合成了24种DES。本文比较了DES的组成(包括铵盐阴离子、氢键供体、盐/氢键供体的摩尔比)以及各种组分对DES-CLEA催化活性的影响,研究了DES-CLEA对p H、温度、有机溶剂、抑制剂的稳定性。实验结果表明,在酪氨酸酶的CLEA制备过程中加入DES确实能有效提高酪氨酸酶交联聚集体的催化活性。在所制备的24种DES中,基于Ch Cl的DES比基于Ch Ac的DES更能使CLEA的酶活性提高,其中Ch Cl/U(1:2)介入的CLEA活性最高,是没有加入DES的CLEA活性的2.2倍。DES虽然能提升CLEA的活性,但对酶的稳定性影响不大。2.酶法合成3,4-二羟基苯乙酸、白皮杉醇、3’-羟基紫檀茋本文应用酪氨酸酶的交联聚集体(CLEA)催化合成三种多羟基化合物:3,4-二羟基苯乙酸、白皮杉醇、3’-羟基紫檀茋,并和酶溶液以及DES-CLEA的催化进行比较。1)3,4-二羟基苯乙酸的合成:最优反应条件是酶量3 m L(酶液)或15 mg(CLEA)、反应温度25℃、p H为6、L-抗坏血酸浓度15 m M(酶液)或20 m M(CLEA)、反应时间2 h,酶液合成3,4-二羟基苯乙酸最大产率为48.9%,CLEA合成3,4-二羟基苯乙酸最大产率为40.5%。在CLEA合成3,4-二羟基苯乙酸最优条件下,与CLEA相同量的DES-CLEA的产率为37.3%。本文中CLEA催化合成3,4-二羟基苯乙酸的速率是340.0 mg/L/h,时空收率是2.0 mmol/L/h,均优于已有的文献报道。2)白皮杉醇的合成:优化后的CLEA合成白皮杉醇的条件为酶量10 mg、温度20℃、底物浓度20 m M、L-抗坏血酸浓度40 m M、反应时间4 h,最大产率为74%。将反应从2 m L体系扩大到25 m L后,产率为52.5%。在CLEA合成白皮杉醇最优条件下,与CLEA相同量的DES-CLEA的产率为52.8%。经1H-NMR鉴定产物确为白皮杉醇。本文中CLEA催化合成白皮杉醇的速率是903.7 mg/L/h,时空收率是3.7 mmol/L/h,远远优于已有的文献报道。本文首次将蘑菇酪氨酸酶应用于合成白皮杉醇,并具有较高的产率,说明蘑菇酪氨酸酶在合成白皮杉醇上具有较大的潜力。3)3’-羟基紫檀茋的合成:在最优条件下,CLEA催化合成3’-羟基紫檀茋的产率为61.7%。经1H-NMR鉴定产物确为3’-羟基紫檀茋。这是首次报道生物法合成3’-羟基紫檀茋,证明生物法合成3’-羟基紫檀茋是可行的。综上所述,DES引入到酪氨酸酶CLEA的制备中,能提升CLEA的活性,对酶的稳定性影响不大;酪氨酸酶的交联聚集体具有应用于合成化合物3,4-二羟基苯乙酸、白皮杉醇、3’-羟基紫檀茋的潜力。