研究背景家族性高胆固醇血症作为常染色体显性遗传疾病的一种，容易导致动脉粥样硬化，增加心血管疾病的患病风险，严重威胁着人类的身心健康。研究表明，高脂血症主要表现为血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的升高，其中85%的LDL-C升高是由于低密度脂蛋白受体（LDLR）编码区的基因突变引起的。由于LDLR在人体内主要通过内吞和细胞内降解的形式来清除血液中的LDL-C，LDLR的缺失或基因突变将直接引起血浆LDL-C的升高。所以，控制LDLR的血浆水平则是降低LDL-C含量的关键所在。近期资料显示，人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)蛋白可以直接增加细胞核或溶酶体内LDLR的降解，升高LDL-C的浓度；也可通过减少进入细胞溶质内的LDLR来增加LDL-C的含量。且pcsk9蛋白的血浆含量与LDL-C的水平呈明显的正相关。此外，人pcsk9基因的多态性与心血管疾病的发生、发展及其预后均有一定的相关性。并且该基因不同的多态性会引起不同水平的血浆LDL-C。其中，功能获得性变异会引起高脂血症，功能缺失型变异则在减少LDL-C含量的同时，还降低了80%患者心血管疾病的患病风险。因此，了解人pcsk9基因的相关特性，监测人pcsk9蛋白的血浆浓度，制备该蛋白的相关生物制剂，可为临床上高脂血症的诊断、监测、预防及治疗提供依据。国际上用于治疗高脂血症的人pcsk9生物制剂以抗体居多，大多还在临床验证阶段，目前的实验结果表明，人pcsk9抗体可以有效地控制LDL-C的水平，降低心血管疾病的患病风险。而国内各试剂厂商推出的人pcsk9相关生物制剂多为进口产品，价格昂贵，种类也主要是用于监测人pcsk9蛋白血浆水平的ELISA试剂盒；大大限制了人pcsk9在国内临床上的广泛推广及应用。鉴于上述情况，本课题将从事人pcsk9的一系列基础研究，构建其原核表达载体，诱导表达蛋白，制备人pcsk9蛋白的多克隆及单克隆抗体，为其服务于临床奠定基础。由于人pcsk9蛋白主要表达于人体的肝脏，而人体的肝脏组织来源相对较困难，从肝脏组织分离纯化人pcsk9蛋白的传统方法，过程繁琐、产率低、蛋白纯度差，不能满足目前临床的需要。所以，本研究采用基因工程的方法，并且充分考虑到大肠杆菌遗传背景低、合成蛋白质时效率高、产量大等特性，在不改变人pcsk9基因编码区序列的前提下人工合成人pcsk9基因，构建其原核表达载体，诱导该表达载体大量表达蛋白，大大降低了生产的成本。同时以该方法获得的重组蛋白为免疫原免疫动物，制备特异性及效价良好的多克隆及单克隆抗体。为进一步研制人pcsk9相关生物制剂奠定基础，同时也为人pcsk9应用于临床监测、预防、治疗高脂血症及心血管疾病提供依据。目的1.构建人前蛋白枯草溶菌素9的原核表达载体；2.诱导构建成功的pcsk9表达载体表达，优化其诱导表达条件，纯化收集表达蛋白；3.用检测过的纯化人pcsk9蛋白免疫新西兰兔，制备pcsk9蛋白的多克隆抗血清，并进行鉴定；4.用检测过的纯化人pcsk9蛋白免疫SPF级的BALB/c小鼠，制备pcsk9蛋白的单克隆抗体，并进行鉴定。方法1.pcsk9基因原核表达载体的构建应用聚合酶链式反应扩增人工合成的人pcsk9基因cDNA序列，扩增产物经电泳仪电泳、EB染色并观察结果。确定目的基因存在后，将扩增产物进行TA克隆；构建PMD-19T-pcsk9载体后，将PET-28b表达载体菌质粒与PMD-19T-pcsk9载体质粒同时进行双酶切、连接，构建pET-28b-pcsk9表达载体；将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21（DE3）的感受态细胞中，进行菌落PCR鉴定，电泳、EB染色后找出阳性菌落，并进行基因测序和双酶切鉴定。2. pET-28b-pcsk9原核表达载体的诱导表达及蛋白纯化分别在温度、诱导剂浓度、诱导剂作用时间、菌液浓度四个不同条件下对重组质粒表达菌pET-28b-pcsk9进行诱导表达，获得pET-28b-pcsk9的最佳诱导表达条件，在最佳诱导表达条件下对重组载体PET-28b-pcsk9进行大量诱导表达；将获得的蛋白经镍柱进行亲和层析纯化，纯化后的蛋白用免疫印迹及BCA法分别检测特异性及蛋白浓度。3.pcsk9蛋白多克隆抗血清的制备及检测用纯化检测过的高浓度的目的蛋白免疫新西兰兔。首次免疫每只兔子取200ug的蛋白与等量的弗氏完全免疫佐剂乳化混匀后进行皮下注射，之后每2周用100ug的目的蛋白与等量的弗氏不完全免疫佐剂乳化混匀后进行皮下注射免疫，共免疫5次。最后采集全血收集血清，获得多克隆抗体，对该多克隆抗体进行纯化。并对纯化后的抗血清进行特异性鉴定及效价测定。4.pcsk9蛋白单克隆抗体的制备及鉴定用纯化检测过的高浓度目的蛋白免疫SPF级的8周龄的BALB/c小鼠，首次免疫每只小鼠取200ug的蛋白与等量的弗氏完全免疫佐剂乳化混匀后进行腹腔注射，之后每3周用100ug的目的蛋白与等量的弗氏不完全免疫佐剂乳化混匀后进行腹腔注射免疫，共免疫5次。之后取免疫过的小鼠脾脏细胞与之前预处理好的小鼠骨髓瘤细胞进行融合培养，制备杂交瘤细胞。最后将杂交瘤细胞分泌液进行免疫印迹检测和效价测定，得到阳性结果后将杂交瘤细胞进行传代培养并冻存。结果1.pcsk9基因原核表达载体的构建Pcsk9目的基因扩增成功，电泳观察存在2000bp左右的目的基因。目的基因进行TA克隆后，成功构建了PMD-19T-pcsk9载体。对构建成功的PMD-19T-pcsk9载体质粒及PET-28b表达载体质粒进行双酶切、连接，连接产物转化后进行菌落PCR，挑选出阳性菌落，送往英俊基因公司测序结果显示无突变，双酶切电泳图说明该表达载体构建成功。2．pET-28b-pcsk9原核表达载体的诱导表达及蛋白纯化将构建成功的表达载体在不同条件下进行诱导表达，得出该原核表达载体的最佳诱导表达条件为菌液光密度值取0.6，诱导温度取30℃，诱导剂终浓度取1.0mmol/L，诱导时间取8小时。诱导后的表达菌裂解液沉淀经SDS-PAGE电泳后在相对分子质量（Mr）标准为Mr66200附近有条带出现，与目的蛋白Mr69000大小相符，且该重组表达载体蛋白的表达以包涵体为主。对比正常诱导表达菌裂解液的沉淀，发现在用100、500mmol/L的咪唑的磷酸盐缓冲液洗涤层析柱时有目的蛋白出现，且用500mmol/L的咪唑的磷酸盐缓冲液洗涤时，效果更佳。该纯化所得目的蛋白浓度经BCA法测定约为333ug/ml。3. pcsk9蛋白多克隆抗血清的制备及检测成功获得了人pcsk9多克隆抗血清，该抗体可以识别纯化的目的蛋白，但不能识别PET-28b菌株蛋白。自制抗血清的吸光度A值随抗血清稀释度的上升而下降。取抗血清A值为阴性对照值2倍以上的最大稀释度为抗体效价，得出该自制抗血清的效价在1:13200以上。4. pcsk9蛋白单克隆抗体的制备及鉴定成功建立了1株能稳定分泌抗人pcsk9蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为H1。该pcsk9单克隆抗体可以识别纯化的目的蛋白，但不能识别PET-28b菌株蛋白。自制单克隆抗体的OD值随着其稀释倍数的上升而下降，取自制单克隆抗体OD值为阴性对照2倍以上的最大稀释度为该单抗的效价，得出该自制单克隆抗体的效价为1:12800。该自制单克隆抗体亚型为IgG2b，轻链为κ链。该抗体的亲和力K值为2.08145×10-7M。结论1.成功扩增出目的基因，经TA克隆、双酶切、连接、转化及菌落PCR获得阳性克隆，送往基因公司测序无突变，即PET-28b-pcsk9原核表达载体构建成功。2.大量优化诱导表达重组表达载体，纯化检测过的高浓度目的蛋白，具有一定的特异性。该纯化所得目的蛋白浓度经BCA法测定约为333ug/ml。3.获得的多克隆抗血清具有一定的特异性且效价也在1:13200以上。4.筛选出1株能稳定分泌抗pcsk9蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为H1.获得的单克隆抗体具有一定的特异性且效价在1:12800之上，并成功检测出该抗体的亚型为IgG2b，轻链为κ链。该抗体的亲和力K值为2.08145×10-7M。