背景和目的:肠道菌群是对寄居在人体消化道内庞大微生物群体的统称,其数量巨大、种类繁多。正常情况下,人体内的肠道菌群参与机体摄入食物的消化、能量供应、营养及药物的代谢吸收、免疫炎症的调节、维持胃肠道及机体稳态等重要的生理代谢过程。肠道内的益生菌能够增强机体的代谢吸收,并有效发挥对抗病原菌在肠道内定植的功能,形成肠道免疫屏障。研究发现人体肠道菌群失调与结直肠肿瘤、炎症性肠病、肠易激综合症、肥胖、糖尿病等免疫性、代谢性、心脑血管性及肿瘤性疾病均具有一定的相关性。有学者利用高通量测序技术针对结肠肿瘤患者及正常人的肠道菌群进行基因组学测序研究,结果发现,结肠癌患者肿瘤组织中梭杆菌丰度较对应正常组织有明显升高,并先后有多项研究证明结肠癌患者肠腔内肿瘤组织中的具核梭杆菌检出比例明显高于临近正常组织。并且发现结肠腺瘤患者病变组织中具核梭杆菌的丰度高于临近正常组织。有学者开展进一步的细胞学研究发现,具核梭杆菌作用于结肠癌细胞系,主要借助结肠癌细胞表面的E-cadherin/β-catenin复合体的介导,该复合体是具核梭杆菌作用于结肠恶性细胞的重要环节。因此,我们设计开展了本研究计划,目的主要是想要了解具核梭杆菌对人正常结肠上皮细胞系有无影响作用,同时,想要通过本实验初步观察检测,正常肠道环境中出现具核梭杆菌感染后可能出现的细胞体液变化情况。目前,国内关于人正常结肠上皮细胞系——NCM460细胞与具核梭杆菌间所发挥的相关作用机制的研究尚未见报道,本研究的研究目的为:1)建立具核梭杆菌与NCM460细胞共培养模型,了解其是否能对NCM460细胞的增殖活性、迁移能力及炎症因子的表达能力产生影响;2)具核梭杆菌是否通过NCM-460细胞表面E-钙黏蛋白/β-连环蛋白复合体的介导对细胞产生影响。本研究以建立NCM460细胞与具核梭杆菌的共培养模型作为研究切入点,了解具核梭杆菌对人正常结肠上皮细胞有无影响作用,以及具核梭杆菌与NCM460细胞相互作用的具体机制,为进一步明确具核梭杆菌与结直肠疾病间的相关性提供理论和现实依据。方法:本实验选取人正常结肠上皮细胞系即NCM460细胞与具核梭杆菌作为研究对象,将具核梭杆菌菌悬液与NCM460细胞分别稀释成不同浓度,以不同比例共培养,筛选出合适的细胞、细菌共培养比例,便于开展后续实验。第一部分实验:1)细胞划痕实验检测NCM460细胞与具核梭杆菌共培养后,对细胞的迁移能力的影响,并设置大肠杆菌DH5α阳性对照组及空白对照组;2)具核梭杆菌与NCM460细胞共培养一定时间后,利用细胞计数方法及CCK-8实验绘制细胞增殖曲线,了解细胞增殖活性改变情况,设置大肠杆菌DH5α阳性对照组及空白对照组;3)NCM460细胞与具核梭杆菌共培养一定时间段,分别于不同时间点取出共培养样本通过流式细胞仪检测各实验组中不同细胞周期细胞数所占比例,分析各实验组中NCM460细胞通过细胞周期中的哪些增殖阶段,引起细胞增殖活性的变化;4)收集NCM460细胞与具核梭杆菌共培养后的细胞蛋白,然后通过蛋白免疫印迹法,检测NCM460细胞中P-P56、IL-6、IL-1β、MMP-13的表达情况,了解NF-k B炎症通路的激活情况,以及下游炎症因子的变化。设置GAPDH作为内参对照。第二部分实验:1)收集NCM460细胞与具核梭杆菌共培养后的细胞蛋白,然后采用western-blot检测方法,观察细胞内E-钙黏蛋白、β-连环蛋白的表达变化情况,设置GAPDH作为内参对照;并利用显微镜观察细胞形态的改变,2)采用E-钙黏蛋白si RNA或β-连环蛋白si RNA分别转染NCM460细胞,再通过细胞免疫荧光检测及Western-blot检测细胞内E-钙黏蛋白、β-连环蛋白的表达,确定转染成功;E-钙黏蛋白或β-连环蛋白沉默表达的NCM460细胞与具核梭杆菌共培养一定时间后,流式细胞仪检测各组细胞中细胞周期比例的改变,分析细胞增殖活性的具体细胞周期改变情况,并设置空白对照组;3)E-钙黏蛋白或β-连环蛋白沉默表达的NCM460细胞与具核梭杆菌共培养一定时间后,采用q RT-PCR的检测方式及western-blot检测方法,了解NCM460细胞表达炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MMP-13的表达情况,GADPH作为内参对照,然后分析E-钙黏蛋白/β-连环蛋白在具核梭杆菌干预NCM460细胞过程中的参与机制。结果:第一部分实验:1)细胞划痕实验结果显示,细胞与具核梭杆菌共培养48h后,NCM460细胞的迁移能力较对照组有明显增强表现;2)细胞计数及CCK-8实验结果显示,具核梭杆菌共培养组中NCM460细胞的生长,在24h,48h及72h观察时均发现较对照组细胞有明显增殖增强改变;3)流式细胞仪检测结果提示,NCM460细胞与具核梭杆菌共培养组细胞中处于S期及G2/M期的细胞比例明显增多;4)具核梭杆菌感染NCM460细胞使P-P65表达量明显增多,并且发现细胞炎症因子IL-6,IL-1β及MMP-13的蛋白表达也增多,具有统计学意义。第二部分实验,为进一步阐明具核梭杆菌是否借助细胞内的E-钙黏蛋白或β-连环蛋白对NCM460细胞产生影响:1)首先发现具核梭杆菌与NCM460细胞共培养后,细胞表面E-钙黏蛋白或β-连环蛋白的表达与对照组间未发现差异性;2)转染E-钙黏蛋白si RNA或β-连环蛋白si RNA至细胞,分别检测确定NCM460细胞内的E-钙黏蛋白或β-连环蛋白基因沉默表达成功;3)检测发现当细胞内E-钙黏蛋白基因沉默表达时,具核梭杆菌感染对细胞内炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β及MMP-13的表达无影响,并且具核梭杆菌干预组内细胞周期比例未发现具有统计学意义的变化;4)当转染作用使细胞内β-连环蛋白沉默表达时,细胞内炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β及MMP-13的表达水平升高,并且观察到具核梭杆菌干预细胞组内S期细胞数所占比例增多。结论:研究数据表明NCM460细胞感染具核梭杆菌促使细胞的增殖活性、迁移能力均增强。具核梭杆菌对NCM460细胞的干预作用,刺激NF-k B炎症通路相关的磷酸化P65表达增多,同时通路下游的相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β及MMP-13的表达增多。同时发现,具核梭杆菌干预作用能够增强细胞增殖活性。而通过细胞转染的方式对比分析发现,具核梭杆菌对NCM460细胞的干预作用需要E-钙黏蛋白参与介导,E-钙黏蛋白为具核梭杆菌作用于细胞的重要位点,这为进一步明确具核梭杆菌与结直肠疾病间的相关机制研究提供线索。