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目的顺铂(cisplatin,CP)是当前运用最广泛的抗肿瘤药物之一,但它对细胞的毒性作用(肾毒性、耳毒性、神经毒性等),在一定程度上限制了该药物在肿瘤治疗领域中的应用。本课题基于小鼠胚胎干细胞,采用基因组学的方法,找出顺铂对小鼠胚胎干细胞毒性相关基因,并分析这些基因的生物学功能,继而探讨顺铂导致小鼠胚胎干细胞毒性的分子生物学机制,以期能为进一步研究顺铂的细胞毒性奠定基础。方法1.小鼠成纤维细胞和小鼠胚胎干细胞的培养：选用12.5天胎龄的胎鼠制备原代小鼠胚胎成纤维细胞,培养至3到5代时,用10μg/ml丝裂霉素C处理2.5小时,制备饲养层细胞,以1×105个/ml细胞接种于培养瓶中。12小时后,将1.5×105个/ml小鼠胚胎干细胞接种在饲养层细胞上,置于37。C,5%CO2条件下培养,每天换液,2-3天传代。2.测定不同浓度顺铂对小鼠胚胎干细胞活力的影响：取5mg/ml顺铂,用培养液依次稀释成40、20、10、5、2.5、0.5、0.1、0.02、0.004μg/ml (?)的样品。将饲养层细胞以1×105个/ml,小鼠胚胎干细胞以1.5×105个/ml,接种于96孔板中,加入不同浓度的顺铂,100μl／孔,同时设空白对照组,培养板于37℃5%CO2培养箱,每天换液,孵育48h, MTT法检测不同浓度顺铂对细胞活力的影响,计算各浓度下的抑制率,用SPSS11.5软件处理,得出IC10值。3.小鼠胚胎干细胞表达谱芯片实验和顺铂毒性差异性表达基因的筛选及差异性基因分析：以IC1(]浓度的药物作用于胚胎干细胞,设置空白对照组,每天更换含药培养液,于48小时收集细胞,提取和纯化顺铂IC1o的剂量作用后的小鼠胚胎干细胞总RNA,继而合成其cDNA,再合成和纯化其aRNA,杂交、洗脱、扫描芯片,收集数据。应用Affymetrix的DNA-Chip Analyser (dChip)(version2009)对信号的强度和比值进行计算和统计分析,找出差异性表达基因。对差异表达基因进行GO注释,并利用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库,作Pathway分析,生物功能及生物过程分析,初步分析差异性表达基因的功能。结果1.采用37℃热消化法制备的小鼠胚胎成纤维细胞呈梭形或不规则三角形,细胞核较大,细胞界限清晰,细胞折光性和立体感好。此方法操作时间短,步骤简单。2.MTT法显示：不同浓度的顺铂作用于小鼠胚胎干细胞48h后,均可对其产生毒性,顺铂IC10值为0.5471μg/mL。3.小鼠胚胎干细胞表达谱芯片的扫描结果,共得到差异表达2倍以上基因2686个,其中上调基因1718个,下调基因968个,差异表达倍数大于4倍的有37个基因,其表达全部上调。结论1.本实验摸索出的胎鼠原代成纤维细胞饲养层的制备方法,简便易行适于小鼠胚胎干细胞的培养。2.小鼠胚胎干细胞培养方法为研究顺铂诱导小鼠胚胎干细胞毒性提供了一个可靠而理想的平台。3.不同浓度的顺铂作用于小鼠胚胎干细胞48h后,均可对其产生毒性。4.在对差异表达倍数大于4倍的37个基因中的10个基因做了进一步分析后,初步认为炎症、氧化应激、细胞凋亡可能是顺铂导致小鼠胚胎干细胞毒性的主要分子生物学机制。细菌内毒素可能会加重顺铂的细胞毒性,提示我们在临床使用顺铂治疗时,应尽量防止患者发生医院感染。