神经病理性疼痛是临床顽症之一,长期困扰患者并严重影响其生活质量。脊髓背角是机体对伤害性信息进行自身调制或整合的重要位点。它不仅是神经活性物质和受体分布最多和含量最丰富的部位,也是痛、触、温觉神经元主要分布的区域之一。研究脊髓背角部位疼痛相关的调控因子有助于了解神经病理性疼痛发生和维持的机制。以往大量研究表明脊髓小胶质细胞的激活是神经病理性疼痛产生和持续的关键因素,但目前对于其活化的分子和细胞机理尚需深入探讨。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）是参与脊髓水平伤害性信息调制的一种重要的递质。ATP通过P2嘌呤受体在中枢神经系统中发挥其重要作用,其中包括7种离子通道型P2X受体和9种G-蛋白偶联P2Y受体。P2X₇受体是P2X家族中一个独特的亚型,研究表明其可能参与了痛觉信息的调制和传导。P2X₇受体在中枢神经系统分布广泛,包括小胶质细胞在内的多种神经细胞上均有其功能性受体的表达。外周神经损伤后,损伤组织细胞和感觉神经末梢释放大量ATP,研究表明ATP可以激活小胶质细胞,诱导小胶质细胞聚集、增生,并促进其释放多种前炎症因子和神经活性物质。但是P2X₇受体是否介导脊髓背角部位小胶质细胞的激活,参与神经病理性疼痛的发生和持续过程目前尚不清楚。本项目拟采用体外培养的小胶质细胞和坐骨神经慢性压迫损伤（chronic constriction of the sciatic nerve injury,CCI）大鼠模型为研究对象,结合在体及离体实验,综合应用形态学、分子生物学和行为学等多种技术方法,观察P2X₇受体激活对小胶质细胞的细胞内游离Ca²⁺浓度(the intracellular concentration of Ca²⁺ ,[Ca²⁺]i)和D-丝氨酸（D-Serine,D-Ser）等氨基酸的释放的影响,初步探讨P2X₇受体激活与小胶质细胞活化的关系及其调控机制;观察CCI模型中脊髓背角部位小胶质细胞激活与P2X₇受体表达变化的规律及关系,证实P2X₇受体介导小胶质细胞活化参与神经病理性疼痛。该研究对阐明神经病理性疼痛的机制具有重要意义。方法:体外培养BV-2小胶质细胞,免疫荧光标记技术观察BV-2小胶质细胞CD11b、P2X₇受体和丝氨酸消旋酶（Serine racemase,SR）的表达;免疫组织化学染色观察ATP、BzATP作用后BV-2小胶质细胞CD11b、SR表达的变化;激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscopy,CLSM）观察ATP、BzATP作用下BV-小胶质细胞[Ca²⁺]i变化;应用高效液相色谱技术（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）观察ATP、BzATP作用下BV-2小胶质细胞D-Ser等氨基酸类递质的释放;制备坐骨神经慢性压迫损伤模型(,免疫组织化学染色和免疫印迹技术（Western blotting）观察脊髓背角P2X₇受体表达变化;免疫荧光双重标记技术对脊髓P2X₇受体表达进行细胞定位;制备鞘内插管后的CCI大鼠模型,鞘内给予P2X₇受体特异性拮抗剂亮蓝G（Brilliant blue G,BBG）后,免疫组织化学染色观察脊髓背角小胶质细胞活化和OX42表达变化;热辐射法和Von Frey（vFh）纤维丝测痛检测大鼠热痛阈和机械性痛阈的变化。结果:第一部分:1.培养的BV-2小胶质细胞,免疫荧光标记鉴定其CD11b阳性率>99%,符合实验要求。免疫荧光双重标记表明小胶质细胞表达P2X₇受体蛋白,其阳性呈细小颗粒状,主要分布于小胶质细胞的胞膜和胞浆内。2.0.1μmol/L和1μmol/L的ATP并不能引起小胶质细胞[Ca²⁺]i升高,10μmol/L ATP才可引起小胶质细胞[Ca²⁺]i升高,而1μmol/L的BzATP即可引起小胶质细胞[Ca²⁺]i升高,而且随着浓度的升高ATP和BzATP诱发的[Ca²⁺]i更为明显,存在一定的剂量依赖关系。100μmol/L ATP、BzATP均则可引起小胶质细胞[Ca²⁺]i显著的升高;而且BzATP诱发的[Ca²⁺]i浓度升高要比ATP诱发的[Ca²⁺]i浓度升高更为持久。3.100μmol/L ATP、BzATP作用于小胶质细胞可促进其[Ca²⁺]i升高,而在预孵育P2X₇特异性阻断剂BBG（100nmol/L） 20min后ATP、BzATP诱发的小胶质细胞[Ca²⁺]i反应完全被抑制。4.将细胞培养液更换为无钙液预孵育20min后,100μmol/L BzATP诱发小胶质细胞[Ca²⁺]i升高被抑制。5.100μmol/L ATP、BzATP作用于小胶质细胞24h后可以促进其活化标记物CD11b表达明显升高,而预孵育BBG可以抑制这一表达上调效应。第二部分:1.100μmol/L ATP、BzATP作用于小胶质细胞10min后培养液中甘氨酸（Glycine,Gly）浓度显著增加,但天冬氨酸（Aspartic acid,Asp）和谷氨酸（Glutamate;Glu）浓度未见明显变化。预孵育BBG 20min后,再加入ATP、BzATP作用于小胶质细胞10min后培养液Gly浓度与PBS对照组未见明显变化。2.在移除了细胞外Ca²⁺后,100μmol/L BzATP作用于小胶质细胞10min后,其培养液Gly浓度与未移除细胞外Ca²⁺没有明显变化。预孵育100μmol/L蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）阻断剂白屈菜红碱（Chelerythrine chloride,Che）后再加入BzATP,其培养液Gly浓度与未孵育Che时相比有所降低,但仍要高于PBS对照组。而预孵育100μmol/L蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）阻断剂H-89后再加入BzATP,其培养液Gly浓度与未孵育H-89时未有明显变化。3.100μmol/L ATP、BzATP短时间（10min）作用于小胶质细胞,其培养液中D-Ser未见明显变化,但较长时间作用（24h）后小胶质细胞的培养液中D-Ser浓度显著增加,表明其D-Ser浓度增加可能与D-Ser合成有关;预孵育BBG 20min后再加入ATP、BzATP作用小胶质细胞24h后培养液中D-Ser浓度明显降低,与PBS组相比没有显著差异。4.在移除了细胞外Ca²⁺后,100μmol/L BzATP作用于小胶质细胞24h后,其培养液D-Ser浓度与未移除细胞外Ca²⁺时相比有所降低,但仍要高于PBS对照组。预孵育100μmol/L Che后再加入BzATP,其培养液D-Ser浓度与未孵育Che时相比有所降低,但仍要高于PBS对照组。而预孵育100μmol/L H-89后再加入BzATP,其培养液Gly浓度与未孵育D-Ser时未有明显变化。5.免疫荧光双重标记表明小胶质细胞上有SR的表达,且大部分在小胶质细胞上与P2X₇受体共表达;100μmol/L ATP、BzATP刺激小胶质细胞可促进SR表达升高,这一效应可在预孵育BBG后被抑制。第三部分:1.成功制备了大鼠坐骨神经慢性压迫（CCI）模型,动物表现出典型的神经病理性疼痛相关痛行为,且CCI大鼠术后机械性痛阈和热痛阈均降低,于14d达到最低,与正常对照大鼠和假性手术大鼠具有显著性差异。正常对照组大鼠及假性手术组大鼠的机械痛阈和热痛阈在整个观察周期内也相对稳定,未出现显著变化。2.免疫组织化学和Western blotting结果显示大鼠CCI术后,其脊髓背角P2X₇受体表达显著增加,14d达到峰值,21d仍高于正常对照和假性手术组大鼠;其表达的变化趋势在时程上与大鼠热痛阈和机械痛阈的变化趋势表现一致。此外,P2X₇受体表达的增加主要集中于与痛觉信息密切相关的I-IV层。3.免疫荧光双重标记结果显示P2X₇受体阳性细胞同时也表现为小胶质细胞特异性标记物CD11b（OX42）阳性,而其阳性结果并不与星形胶质细胞特异性标志物胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）和神经元特异性标记物微管相关蛋白2（Microtubule-associated protein 2, MAP2）阳性结果重叠。4.鞘内给予0.9%NaCl的CCI大鼠其损伤同侧后肢机械痛阈和热痛阈变化趋势与之前未给药的CCI大鼠基本一致, 3d时即表现为显著下降,14d达到峰值,直至21d依然低于正常水平。给予BBG的CCI大鼠其损伤同侧后肢热痛阈CCI术后3d也表现为降低,14d时达到峰值,21d仍未完全恢复,但要高于同一时间节点的给予0.9%NaCl的CCI组大鼠和未给药的CCI大鼠,且差异具有统计学意义。5.免疫组化结果显示,大鼠CCI术后其损伤同侧脊髓背角OX42表达3d时即显著增加,14d达到峰值,高水平的OX42表达一直持续至21d。鞘内给予CCI大鼠BBG14d后,其脊髓背角OX42的表达较同一时间节点的给予0.9%NaCl组和未给药的CCI大鼠相比明显减少,但仍高于正常对照组大鼠,且具有显著性差异。而且CCI术后14d和鞘内给予生理盐水的CCI组其脊髓背角小胶质细胞胞体明显变大,突起变短,呈现明显的活化状态,鞘内给予BBG的CCI大鼠小胶质细胞胞体和突起虽然也出现相应变化,但活化程度不如CCI组和给予生理盐水组的明显。结论:1.P2X₇受体表达于培养的BV-2小胶质细胞上,且参与介导BV-2小胶质细胞活化;2.ATP、BzATP激活P2X₇受体后诱发小胶质细胞[Ca²⁺]i升高;此效应可能与细胞外Ca²⁺大量内流有关;3.ATP、BzATP可促进小胶质细胞释放Gly,但不影响Asp和Glu的释放。这一效应是由P2X₇受体参与介导,并受到PKC的调控,而与细胞外Ca²⁺浓度和PKA无关;4.ATP、BzATP激活P2X₇受体后诱发小胶质细胞中D-Ser合成、释放增加升高,这一效应受到细胞外Ca²⁺浓度和PKC的调控,但与PKA无关5.培养的BV-2小胶质细胞上有SR表达。ATP、BzATP通过P2X₇受体途径可促进小胶质细胞上SR的表达,可能是ATP、BzATP诱发小胶质细胞中D-Ser合成、释放增加的作用机制。6.大鼠脊髓背角P2X₇受体特异地表达于小胶质细胞,并在神经病理性疼痛模型中表达增加,促进了CCI术后脊髓背角小胶质细胞的活化,并与神经病理性疼痛条件下热痛敏和机械性痛敏的发生、持续密切相关。综上所述,脊髓背角P2X₇受体特异性的表达于小胶质细胞,在神经病理性疼痛模型中表达升高,参与介导神经病理性疼痛下脊髓小胶质细胞活化,并可能通过促进小胶质细胞释放Gly、D-Ser等氨基酸类递质释放,从而参与调控神经病理性疼痛的发生发展过程。脊髓小胶质细胞上的P2X₇受体也可能成为神经病理性疼痛治疗新的靶点。