本研究用逆转录病毒将牛Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc四个转录因子导入牛皮肤成纤维细胞,首次成功获得重编程牛iPS细胞,经检测这些细胞具有多能干细胞的生长特征和多向分化能力。为了研究相关转录因子对诱导细胞重编程的必要性,本试验从四因子组合中依次减少转录因子的数量,以避免或减少细胞的癌变,分析了3因子(Oct4,Sox2和Klf4)、2因子(Oct4和Sox2)和1因子(Oct4)诱导细胞重编程的能力和效率。(1).牛Oct4与c-Myc基因克隆及逆转录病毒表达载体的构建通过RT-PCR方法,从Holstein奶牛胎儿原始生殖嵴总RNA中克隆了牛Oct4和c-Myc基因ORF全长。与GenBank中牛Oct4和c-Myc基因编码序列进行BLAST分析,同源性分别为99.4%和99.8%。氨基酸序列同源性分别为98.9%和99.5%。通过酶切位点连接入逆转录病毒载体pMSCV,成功构建的重组质粒分别为pMSCV-Oct4(MO)和pMSCV-Myc(MC)。重组质粒MO与MC经测序分析,表明克隆目的基因序列正确。(2).感染性重组逆转录病毒的包装与鉴定在用重组质粒MO和MC转染包装细胞的同时,用带绿色荧光蛋白的pMSCVneo-IRES-GFP质粒作对照,即用同样的浓度和方法共同转染包装细胞PT67,可观察到有50%左右表达绿色荧光蛋白的发光细胞。用流式细胞仪分析瞬时转染后的PT67-Oct4和PT67-Myc两株细胞中发荧光的细胞各占53.1%和51.3%。用TRIzol LSReagent提取病毒上清总RNA,进行RT-PCR扩增。分别获得Oct4和c-Myc基因单一的1038bp和1320bp大小的条带。PT67-Oct4和PT67-Myc细胞培养液经磷钨酸负染后透射电镜观察,可见多个病毒颗粒。收集细胞培养上清感染NIHA3T3细胞,测得病毒滴度分别为8.83×107cfu/mL和8.50×107cfu/mL,说明试验获得高感染力的逆转录病毒。(3).四个转录因子组合诱导成年牛皮肤成纤维细胞重编程为多能干细胞试验用四个转录因子(Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc)共同感染牛皮肤成纤维细胞,以hAM为饲养层,添加hLIF和bFGF的iPS细胞培养液获得ES细胞样克隆。经检测表达碱性磷酸酶；通过定量PCR方法,分析其多能性基因表达量与PGCs相当,在感染60天后已经检测不到外源基因的表达。免疫细胞化学检测,表达SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81,以及表达干细胞相关的特异性蛋白OCT4, NANOG, SOX2与端粒酶。Western blotting分析,表达Nanog, Oct4, Sox2, c-Myc和Klf4蛋白。通过亚硫酸氢盐-基因组测序法,检测NANAOG和OCT4基因启动子区甲基化水平处于低甲基化状态,说明多能性基因重新被激活参与基因的表达调控。根据传代计数结果,所得两株牛iPS细胞均呈现指数增长,80天内分别获得细胞数1.5×1011和2.4×1011个。本实验得到的2株牛iPS细胞已经传至第30代冻存。在体外传代大于150天,其形态仍与ES细胞相似,未出现分化迹象。分析第20代BiPSO细胞的核型,具有正常的60XX二倍体核型。(4).诱导性多能干细胞分化多能性检测通过类胚体介导体外分化,在EB周围已分化细胞中检测出表达βⅢ-tubulin, Nestin和GFAP等标志的神经样细胞,α-Actin标志的心肌样细胞,波形蛋白(Vimentin)标志的成纤维样细胞,α-甲胎蛋白标志的肝上皮样细胞,CK7标志的胃肠上皮细胞和PDX-1为标志的胰岛样细胞。RT-PCR对三胚层细胞特异性基因进行分子生物学检测,表达三个胚层细胞的特异性条带,包括Nestin和βⅢ-tubulin(外胚层)；GATA4和ACTA2(中胚层)；Keratin-14、PDX-1和AFP(内胚层)。说明牛iPS细胞有向三个胚层细胞分化的潜能。对牛iPS细胞用DMSO诱导液进行诱导分化,能提高其体外分化为心肌细胞的效率。用RA诱导液进行诱导分化,能在体外分化出成熟的神经细胞。在裸鼠体内能够形成畸胎瘤,H.E.染色显示,有包含三胚层在内的各种组织,如血管、肌肉、软骨,内脏上皮和神经组织。说明牛iPS细胞在体内有向三个胚层细胞分化的潜能。(5).减少诱导因子对诱导牛多能干细胞的影响用Oct4, Sox2和KLF4三因子诱导细胞重编程试验显示,在不用c-Myc转录因子也能够获得牛iPS细胞,但重编程效率降低,与四因子诱导时差异极显著(P<0.01)。经过RT-PCR和免疫细胞化学鉴定重编程的细胞表达OCT4, SOX2, NANOG转录因子及SSEA-3和SSEA-4表面抗原。但没有检测到端粒酶的激活。体外分化实验显示检测到神经样细胞,骨骼肌样细胞,腔上皮样细胞。RT-PCR检测显示除了AFP和Nestin,有多种分化基因的表达。体外分化试验显示注入裸鼠皮下的重编程细胞形成畸胎瘤,组织切片观察到肌肉组织和血管样组织,没有观察到外胚层和内胚层的组织结构。说明该株牛iPS细胞有分化三胚层细胞的能力,但不完全。可能三因子诱导的试验只获得了部分重编程的iPS细胞。用Oct4和Sox2两因子诱导细胞重编程时重编程效率极低,不能获得有效传代的牛iPS细胞。只用Oct4一因子诱导细胞重编程的试验没有获得AP染色阳性的iPS细胞集落。