牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)包括牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)和牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)，属于非胶原蛋白，因最早被发现是由成牙本质细胞合成和分泌，一度被认为是牙本质的特异性蛋白而得名。近年来的研究表明，DSPP在其他组织和器官(如骨、软骨、内耳等)中也表达，只是表达水平相对较低而已，提示DSPP的功能可能并非局限于牙齿的发育和矿化。为进一步探讨DSPP在牙齿发育和矿化中的作用，并在此基础上对DSPP的功能做更加全面的研究，本研究在DSPP功能研究的在体模型的构建方面做了一些尝试，核心内容是建立DSPP的转基因和基因敲除小鼠系。本文是全面研究规划中的一部分，即DSP转基因小鼠模型、DSPP四环素调控性转基因小鼠体系、DSPP特异性启动子调控LacZ转基因小鼠模型的建立和DSPP基因敲除载体的构建以及胚胎干细胞基因打靶。 一、DSP转基因小鼠模型的构建 通过亚克隆将pcDNA3.1中的CMV启动子替换为cβ-actin启动子，构建载体pcDNA3.1-CX，然后将PCR获得的、末端带有HA-Tag的DSP基因编码序列克隆到pcDNA3.1-CX中，构建DSP转基因载体pcDNA3.1-CX-DSP；用显微注射的方法将BglII酶切线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄 第四军医大学博士学位论文原核，移植到假孕母鼠的输卵管；仔鼠出生后，用PCR、基因组Southern杂交检测阳性小鼠，结果获得4只GO代小鼠（founder）；阳性鼠分别传代开始建系。选其中一个单系进行了初步的分析，RTPCR显示转基因能在多个器官中表达。h、DSPP四环素调控性转基因小鼠体系的构建 将pTetonNSE载体中的NSE启动子替换为启动于c p仓ctin，构建调控载体pTeton（X；将DSPP基因编码序列克隆到pTREZ中，构建受控载体pTREZ＊SPP通过显微注射将线性化载体导入小鼠受精卵，制备GO代小鼠，经PCR、基因组Soutnern杂交检坝卜性小鼠，pTeton－CX手pTREZoSPP分别获 11只、10只GO代小鼠。阳性鼠分别传代开始建系。选pTet｛n（X转基因小鼠一个单系进行了初步的分析，RTPCR结果表明小鼠多种器官中均可表达转录因子tTA。三、DSPP基因特异性启动子的克隆和pTNlPM工acZ转基因小鼠的构建 据文献报道，在软件DNAstar辅助下设计一对引物，以小鼠基因组DNA为模板，PCR获得约1石 kb的片段，序列测定证实为DSPP基因特异性启动子；通过亚克隆构建了特异性启动子一LacZ转基因载体，命名为pTN－DPM工acZ，显微注射法制备pTN0PM＊acZ转基因小鼠。经PCR筛选，共获得 12只GO代小鼠。四、DSPP基因敲除载体的构建和ES细胞基因打靶的尝试 根据NCBI GenBank提供的序列，软件辅助设计并合成上、下游两条同源臂的两对引物：以用细胞基因组＊＊A为模板，P＊R获得上、下游两条同源臂；将同源臂测序确认后，和筛选标志按一定顺序克隆到载体pBluescript中，构建了G418筛选的们打靶载体和G418／GANC筛选的＃2打靶载体；酶切和序列测定确认构建无误后，N。ti酶切使载体线性化用于ES 3 第四军医大学博士学位论文细胞基因打靶。共进行了 3次打靶，鉴定了 3 74个细胞克隆。虽然没有获得阳性克隆，但得到了一定的经验，为以后的研究打下了基础。 DSP转基因小鼠模型、DSPP四环素调控性转基因小鼠体系、DSPP特异性启动子一LacZ转基因小鼠模型的建立以及DSPP基因敲除载体的构建和ES细胞基因打靶的尝试，为全面研究DSPP的功能奠定了基础。