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下颌骨不对称畸形是最常见的颅颌面畸形之一,目前尚无一种最佳的治疗方法。髁突软骨内成骨是哺乳动物出生后其下颌骨主要的生长发育方式,软骨内成骨有两个重要的过程：软骨细胞的增殖分化；及成骨细胞、破骨细胞等参与的骨形成。PTH是由甲状旁腺分泌的,维持机体钙磷代谢的重要激素之一。目前研究已经发现PTH对骨形成具有双重作用,但PTH是否对软骨细胞的增殖分化也具有双重调控作用尚不清楚。本研究通过下述三部分实验,应用免疫组化、细胞增殖检测、ALP活性检测、矿化结节染色和real-time PCR等方法,比较了间歇／持续应用PTH刺激原代髁突软骨细胞后其增殖、分化等方面的变化,为将来有可能应用PTH调控髁突软骨内成骨,达到治疗下颌骨不对称畸形的目的,提供实验及理论依据。第一部分髁突软骨细胞的分离、培养和鉴定目的：探讨髁突软骨的分离培养方法,获得具有良好增殖分化能力的髁突软骨细胞。方法：取24h内雌性新生大鼠,采用改良胰酶和Ⅱ型胶原酶联合酶消化法分离髁突软骨细胞,体外培养所分离的软骨细胞。于软骨细胞接种第3天,即爬片细胞刚开始融合时,及细胞培养第10天分别行Ⅱ胶原、Ⅹ胶原免疫组化染色。细胞活力分析仪计数仪测定细胞接种第1天到第7天细胞数量,CCK-8试剂盒检测细胞接种第1天到第7天细胞增殖能力。结果：软骨细胞接种第3天,所有细胞胞浆均有Ⅱ型胶原的强表达,X胶原表达很弱。软骨细胞接种第10天,细胞胞浆Ⅱ型胶原的强表达减弱,X胶原表达增强。当细胞接种第3天和第4天为细胞对数增殖期。结论：胰酶和Ⅱ型胶原酶联合消化法可获得纯度高、增殖分化能力良好的髁突软骨细胞。第二部分不同浓度PTH对髁突软骨细胞作用的研究目的：探讨不同浓度PTH对髁突软骨细胞增殖分化相关基因表达的影响。方法：取24h内雌性新生大鼠,改良的胰酶和Ⅱ型胶原酶联合酶消化法分离,并培养髁突软骨细胞。根据应用PTH的方法,将细胞分为间歇应用组、持续应用组和空白组三组。间歇应用组：每48h的前6h加入相应浓度的PTH,刺激6h后更换为不含PTH的矿化培养基,直至48h；持续应用组：每48h的前6h加入相应浓度的PTH,当作用6h后更换为含有相同浓度PTH的矿化培养基,直至48h；空白组：其矿化培养基中不加入PTH,在每48h的第6h更换矿化培养基一次。按照应用的PTH浓度将前两组又分别分为10-11M、10-10M、10-9M、10-8M和10-7M 5个亚组。分别于细胞培养第10天和第20天提取各组细胞总RNA,转录cDNA后,采用real-time PCR方法检测各组细胞中Ⅱ型胶原、ⅹ型胶原和ALP mRNA的表达。结果：细胞培养第10天时,间隙应用组Ⅱ型胶原和持续应用组X型胶原及ALPmRNA的表达分别是三组细胞中最低,并随着PTH浓度的增高其表达逐渐降低,当应用的PTH浓度为10-8M浓度时下降接近最低值；持续应用组Ⅱ型胶原和间隙应用组Ⅹ型胶原mRNA的表达分别是三组细胞中最高,且随着PTH浓度的增高其表达逐渐上升,并在10-8M浓度时上升接近最高值。细胞培养第20天时,髁突软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达较第10天明显降低,各组间没有明显的差异；间歇应用组Ⅹ型胶原和ALP mRNA表达最高,而持续应用组X型胶原和ALP mRNA表达最低,各浓度亚组间的表达没有差异。结论：不同浓度PTH间歇／持续应用于髁突软骨细胞后,髁突软骨细胞增殖分化标志性基因mRNA表达水平是不一样的,10-8M是PTH最佳的应用浓度。第三部分间歇／持续应用PTH对髁突软骨细胞增殖分化的影响目的：探讨间歇／持续应用PTH对髁突软骨细胞增殖分化的影响。方法：取24h内雌性新生大鼠,改良的胰酶和Ⅱ型胶原酶联合酶消化法分离并培养髁突软骨细胞。根据PTH应用方式将细胞分为间歇应用组、持续应用组和空白组三组。CCK-8试剂盒检测第0天到第7天细胞增殖能力,分别于第0、4、8、12、16及20天行茜素红S矿化结节染色、ALP活性检测及应用real-time PCR检测各组髁突软骨细胞中Ⅱ型胶原、X型胶原和ALP mRNA的表达。结果：间歇应用组髁突软骨细胞增殖缓慢,持续应用组细胞增殖迅速。细胞培养前12天,各组髁突软骨细胞均无矿化结节形成；第12天时,间隙应用组细胞中开始出现少量矿化结节；当培养至第20天时,间歇应用组细胞形成的矿化结节最多,持续应用组最少。间歇应用组髁突软骨细胞的ALP活性明显要强于其他组,且上升幅度快；而持续应用组细胞中的ALP活性要低于其他两组活性,且上升缓慢。随着细胞培养天数的增加,髁突软骨细胞中Ⅱ型胶原mRNA的表达逐渐减弱,间歇应用组下降的最明显,而持续应用组下降的最为缓慢；X型胶原和ALP mRNA表达在三组中都有所增强,间歇应用组增强最明显,而持续应用组比较缓慢。结论：间歇／持续应用PTH对髁突软骨细胞的增殖分化有着不用的效应：间歇应用PTH促进软骨细胞的分化,抑制其增殖；持续应用PTH则促进其增殖,抑制其分化。