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目的:非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是常见的慢性肝病,已迅速成为世界范围内的主要公共卫生问题。目前,NAFLD的治疗以生活方式干预和辅助药物治疗为主,但临床仍无特效治疗药物,因此潜在有效治疗药物的开发具有重要的临床和社会价值。内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）是NAFLD的关键病理机制。本课题拟首先通过生物信息学分析NAFLD的富集信号通路,然后通过动物模型及细胞实验观察橙皮苷（Hesperidin,HSP）对NAFLD的潜在治疗作用,并探讨其与ERS及其诱导的炎症作用相关的机制。方法:1.采用生物信息学分析方法,分析NAFLD相关基因表达数据集GSE48452和GSE89632中NAFLD患者与健康供体之间的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,并采用GO富集分析和KEGG通路研究探讨所有DEGs的生物学功能和途径;2.SD大鼠随机分为4组,即正常饮食（normal diet,ND）组、ND+HSP组、高脂肪饮食（High fat diet,HFD）组、HFD+HSP组。大鼠适应性喂养一周后,以HFD喂养12周诱导NAFLD,以ND喂养的大鼠作为对照,期间大鼠每天分别按体重给予HSP或生理盐水（NS）。实验结束后采集血液、肝脏组织。采用油红O染色法检测肝组织脂肪变性,生化分析测定血清中的甘油三酯（Triglyceride,TG）、总胆固醇（Total cholesterol,TC）和低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL）,Western blotting检测肝组织中GRP94、磷酸化胰真核细胞翻译起始因子2激酶（Pancreatic el F-2kinase,PERK）、转录激活因子6（Activating transcription factor 6,ATF6）、磷酸化肌醇需要酶1α（inositol requiring enzyme1α,IRE1α）、转录激活因子4（Activating transcription factor 4,ATF4）蛋白的表达,ELISA法测定血清中游离脂肪酸（Free fatty acid,FFA）、TNF-α、IL-6、IL-1β的水平;3.人THP-1细胞经佛波酯（phorbol ester,PMA）刺激后,以FFA诱导ERS,细胞分别以含溶媒+FFA、HSP+FFA、毒胡萝卜素（Ca2+-ATPase抑制剂,是一种广泛应用的细胞内ERS诱导物）+FFA、HSP+毒胡萝卜素+FFA的无血清培养基培养24h,免疫荧光染色观察细胞GRP94的表达,Western blotting检测GRP94、ATF6、ATF4、p-PERK、p-IRE1α、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的表达。为了进一步观察HSP对肝脏脂质合成的影响,将溶媒+FFA、HSP+FFA、毒胡萝卜素+FFA、HSP+毒胡萝卜素+0.5mmol/L FFA分别刺激共培养的THP-1细胞与Hep G2细胞,Western blotting检测胆固醇调节元件结合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins,SREBP）1c（SREBP1c）、SREBP 2和CCAAT/增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer binding protein,C/EBP）的表达。结果:1.GSE48452中有247个在NAFLD中表达上调的DEGs,165个表达下调的DEGs;GSE89632中有307个在NAFLD中表达上调的DEG和298个表达下调的DEGs。GO生物学功能分析结果显示,GSE48452数据集中的DEGs主要与氧化还原过程、IREL介导的折叠蛋白反应、ATF1-ATF4转录因子复合物、炎症反应、凋亡、免疫反应信号通路相关;GSE89632数据集中的DEGs主要与氧化还原过程、脂质代谢、细胞外泌体、炎症反应、凋亡和内质网膜信号通路相关。KEGG通路分析显示,GSE48452和GSE89632中的大部分DEGs富集在炎症反应和IRE1α活化信号通路中;2.经3个月的喂养,HFD（HFD+NS）组大鼠较ND（ND+NS）组体重明显增加,血清FFA含量及TG、TC和LDL含量明显增加。同时,大鼠肝脏组织明显红染,发生明显的脂肪沉积。HFD组大鼠经HSP处理4周后,大鼠体重（523.5±7.2g）明显低于对照组（563.3±9.2g,P＜0.05）;同时,血清FFA水平以及肝脏组织染色阳性区域均显著降低（P＜0.05）。但HSP处理对大鼠血清TC、TG、LDL水平无明显影响（P＞0.05）。同时,ND组大鼠分别给予HSP或对照处理后,两组大鼠体重、血清FFA、TC、TG和LDL水平以及肝脏组织染色均无明显变化。与ND组大鼠相比,HFD组大鼠肝脏组织中GRP94的表达（红色荧光）显著升高（P＜0.05）,而HSP可显著降低GRP94的表达（P＜0.05）。对应的,Western blotting结果显示HFD组大鼠肝脏组织中GRP94、ATF6、ATF4、p-PERK、p-IRE1α蛋白表达水平明显高于ND组大鼠（P＜0.05）,HSP处理可显著降低这些分子的表达水平（P＜0.05）。同时,HFD组大鼠较ND组肝脏组织中的IL-6、TNF-α、IL-1β表达均显著增加,而HSP处理可显著降低其表达水平（P＜0.05）;3.FFA可诱导THP-1细胞中GRP94、p-PERK、p-IRE1α、ATF6以及IL-6、TNF-α、IL-1β的表达,诱导细胞内低水平的GRP94（红色荧光）、p-PERK（绿色荧光）表达,激活ERS并诱导炎症反应,其作用可被毒胡萝卜素进一步增强;HSP可显著抑制细胞中GRP94、p-PERK、p-IRE1α、ATF6以及IL-6、TNF-α、IL-1β的表达（P＜0.05）,降低细胞内GRP94和p-PERK的免疫荧光强度（P＜0.05）;而加入毒胡萝卜素后,HSP对ERS机制相关蛋白以及炎性细胞因子的抑制作用可被消除。4.FFA可诱导与THP-1细胞共培养的Hep G2细胞内SREBP1c、SREBP2、C/EBP表达,激活脂质合成过程;而毒胡萝卜素可显著增强SREBP1c、SREBP 2、C/EBP蛋白表达。HSP可抑制Hep G2细胞内SREBP1c、SREBP2、C/EBP表达（P＜0.05）,但其抑制作用可被毒胡萝卜素消除（P＞0.05）。结论:1.生物信息学分析显示ERS及炎症反应是NAFLD中DEGs富集的信号通路;2.HFD能激活大鼠肝脏组织ERS并诱导炎症反应,导致大鼠体重增加和肝脏组织脂肪变性。HSP可显著抑制NAFLD大鼠肝脏组织ERS相关蛋白表达、炎性细胞因子分泌,从而抑制大鼠体重增加和肝脏脂肪变性;3.FFA能诱导THP-1细胞中ERS相关蛋白表达、炎性细胞因子分泌,同时可增加与THP-1细胞共培养的Hep G2细胞脂质合成蛋白表达。HSP可抑制FFA诱导的THP-1细胞中ERS相关蛋白表达、炎性细胞因子分泌,并抑制FFA刺激的与THP-1细胞共培养的Hep G2细胞脂质合成蛋白表达,其作用可被毒胡萝卜素消除。4.综上,HSP可通过抑制ERS介导的炎症反应,进一步抑制肝细胞脂肪生成,从而抑制肝脏组织脂肪变性和沉积,对NAFLD具有潜在的治疗价值。